[发明专利]牙上皮细胞外泌体制备、外泌体植入物的制备及其应用

权利要求书

1.一种牙上皮细胞外泌体制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

（1）工程化牙上皮细胞系的处理：

1.1、取液氮保存的工程化牙上皮细胞系HERS-H1，用40-50℃温水复苏，接种于10cm培养皿中；

1.2、加入含有2%胎牛血清的上皮细胞培养基，存放于35-38℃，4-5%CO₂ 的培养箱，24-26小时后换液，待细胞融合至80-95%用胰蛋白酶消化传代；

1.3、待扩增出10⁵-10⁸个细胞后，进行工程化牙上皮细胞系提取液的提取；

（2）工程化牙上皮细胞系上清液的获取：

2.1、转移步骤1.3中获取的工程化牙上皮细胞系至T75培养瓶中；

2.2、加入含2%胎牛血清的上皮细胞培养基，存放于 35-38℃，4-5%CO₂ 的培养箱中；

2.3、当细胞密度达到60%-75%时，吸弃培养基，用PBS清洗培养瓶底部2-3次，加入含有2%无外泌体血清的上皮细胞培养基，存放于 35-38℃，4-5%CO₂ 的培养箱中；

2.4、连续培养两天后收集上清液，收集到的上清液以1900-2100g的转速, 离心 28-32min，去除死细胞和细胞碎片，弃沉淀；

（3）工程化牙上皮细胞系提取液的获取：

取离心后的上清液放于100KD膜的离心过滤器中，以3-5℃的温度，4500-5200g 的转速离心 28-32min，进行两次离心，获得的膜上清液即为工程化牙上皮细胞系提取液，提取液于-80℃的环境中进行保存；

（4）工程化牙上皮细胞外泌体的获取：

加入外泌体提取试剂至步骤（3）获得的工程化牙上皮细胞系提取液中，牙上皮细胞系提取液和外泌体提取试剂用量比例为 1.8-2.2：1，在3-5℃下保存12-18小时，以 3-5℃的温度、8000-12000g的转速离心 50-70min，取沉淀，即得工程化牙上皮细胞外泌体；其中外泌体提取试剂为Total ExosomeIsolationTM reagent、ExoQuick-TC或exoEasy Maxi Kit。

2.根据权利要求1所述的牙上皮细胞外泌体制备方法，其特征在于，所述步骤1.1、取液氮保存的工程化牙上皮细胞系HERS-H1，用45℃温水复苏，接种于10cm培养皿中；

1.2、加入含有2%胎牛血清的上皮细胞培养基，存放于37℃，5%CO₂ 的培养箱，24-26小时后进行换液，待细胞融合至90%用胰蛋白酶消化传代。

3.根据权利要求1所述的牙上皮细胞外泌体制备方法，其特征在于，所述步骤2.3中，当细胞密度达到60%-75%时，吸弃培养基，用PBS清洗培养瓶底部2-3次，然后加入含有2%无外泌体血清的上皮细胞培养基，存放于 37℃，5%CO₂ 的培养箱中。

4.一种胶原凝胶复合工程化牙上皮细胞外泌体植入物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将标准型的胶原凝胶置于冰上，同时预冷操作工具；

S2、按8:1:1比例分别向预冷的玻璃离心管中加入胶原凝胶、10×基础培养基和缓冲液混合后放于冰上备用；

S3、取工程化牙上皮细胞外泌体用混合后的液态溶剂重悬，外泌体最终浓度为1.5-2.5mg/ml；

S4、转移混有工程化牙上皮细胞外泌体的液态溶剂至预冷的玻璃管中，置于冰上保存；上述工程化牙上皮细胞外泌体为权利要求1-3任意一项所述制备方法得到的工程化牙上皮细胞外泌体。