[发明专利]一种人呼吸道病原体快速诊断的定量检测方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种人呼吸道病原体快速诊断的定量检测方法和试剂盒，该试剂盒由：至少一种人呼吸道病原体抗体捕获微球、PE标记的检测抗体、病原体蛋白标准品、流式细胞仪校正微球，微球缓冲液、细胞裂解液、样品稀释液、清洗液组成，本发明具有操作简便、快速、自动化，检测结果灵敏度高、检测范围广、重复性好，可实现对人呼吸道上皮细胞和体液中多种病原体的定量检测，且检测对象可灵活组合，能更真实反映病原体的感染情况。

技术领域

本发明属于病原体诊断技术领域，具体涉及了一种人呼吸道病原体快速诊断的定量检测方法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。

背景技术

呼吸道感染是我国最常见的传染性疾病，大多数由呼吸道病毒引起，可分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，。流感病毒（IFV）、副流感病毒（PIV）、腺病毒（HAdV）、偏肺病毒（MPV）、冠状病毒（CoV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、鼻病毒（RhV）、肠道病毒(EV)、博卡病毒（HBoV）、肺炎支原体、肺炎衣原体是常见的呼吸道病原体，因此快速检测病原体种类，对疾病的及时诊断、抗生素和抗病毒药物的合理使用和预防感染有着重要作用。

流式细胞术是利用流式细胞仪快速定量分析细胞群的物理化学特征的技术，主要应用于检测外周血淋巴细胞及其亚群数量，监测HIV感染者疾病的进展；利用流式分选干细胞过继回输用于疾病的治疗，及其辅助白血病的诊断和分型。CBA,微量样品多重蛋白定量技术，是基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法。即利用微小、分散的颗粒微球捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的微球－待测物复合体所散发的荧光，从而测定待测物的数量。目前主要用于检测血液样本中的细胞因子、炎症因子的水平分析。

目前呼吸道病毒感染诊断的金标准仍是病毒的的分离培养，但是细胞培养方法周期长，运输和储存易感染，实际应用受到限制。玻片直接免疫荧光法，则需要通过肉眼观察绿色荧光细胞的数量来判定结果，因此结果的判定具有主观性，且一次只能用单一荧光素标记的抗体，故一次只能鉴定一种病原体，检测效率低。

目前市面上的利用流式细胞术检测呼吸道病原体的技术和产品主要是通过固体液固定住细胞，利用通透剂对细胞内的病毒进行荧光染色，染色效率受通透率影响大，还不能定量分析。

发明内容

本发明提供了一种人呼吸道原体快速诊断的定量检测方法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。本发明检测快速准确，灵敏度高、重复性好，并且操作简便、自动化，可实现单样本的多重定量检测，且检测对象可灵活组合，能更真实的反映病原体的感染情况。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种基于流式细胞检测和微量多重蛋白定量检测的人呼吸道病原体快速诊断和检测的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1)呼吸道病原体抗体和捕捉微球的共价耦合：

将标记有APC荧光素的聚苯乙烯微球分别与人呼吸道病原体抗体偶联（其中人呼吸道病原体包括呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3 型、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、支原体或衣原体），制得人呼吸道病原体抗体捕获微球；不同抗体结合的微球APC荧光强度不同，通过APC荧光强度可识别不同的病原体抗体。

2）检测抗体的荧光标记：

用PE荧光素标记检测抗体，所述检测抗体与捕获抗体为配对抗体。

3）标准曲线的制备：将等比稀释的0-5000 不同浓度的标准品蛋白与捕捉微球和检测抗体等体积混合后，室温避光孵育反应，加入清洗液后，将该复合物置于流式细胞仪，检测PE通道荧光强度，通过FSC和SSC确定微球位置后，再通过荧光强度的不同判定病原体的种类，分别绘制不同病原体蛋白的标准曲线，其中，曲线坐标为病原体浓度和检测平均荧光强度（MFI）。