[发明专利]一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法

说明书

本发明公开了一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法。所述多肽探针包括靶向多肽序列和修饰所述靶向多肽N端的发光物质X，所述靶向多肽序列包含(Hyp‑Hyp‑Gly)n。本发明设计的一种新型多肽探针，对变性的胶原蛋白具有良好的结合能力、生物相容性好、特异性强，而且合成工艺简单，操作流程方便。该探针为癌症、心血管疾病和器官纤维化等重要疾病的分子水平的诊断，提供了一种新的有潜力的检测方法。

技术领域

本发明涉及一种靶向识别变性胶原蛋白的多肽探针及其检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

胶原蛋白是人体内含量最高的蛋白质，是细胞外基质的主要成分，它形成的分子支架，为皮肤、骨骼、肌腱等结缔组织提供结构完整性和机械强度。胶原蛋白具有非常特别的氨基酸序列，它要求每三个氨基酸中必须有一个甘氨酸，形成Gly-X-Y的特征性的重复序列。正常结缔组织的胶原蛋白呈现独特的三重螺旋结构，三条肽链由于链间氢键的相互作用精密堆积在一起。在肿瘤、关节炎等众多病理条件下，胶原蛋白分子的三重螺旋结构会被蛋白酶破坏，生成部分解折叠结构的变性胶原，影响胶原蛋白的正常生理功能。因此，变性胶原蛋白是众多重要疾病的关键生物标记物，建立变性胶原蛋白的高效检测方法，对这些疾病的病理机制的解析和准确诊断至关重要。

目前胶原蛋白的检测方法主要是组织染色法，包括HE染色法、V.G染色法和Masson染色法等。其它的方法包括胶原蛋白抗体，衍生自胶原结合蛋白的肽，以及选自噬菌体表达的肽。这些方法存在操作复杂、探针结合能力弱、特异性不佳等缺陷，同时，它们通常是对所有胶原蛋白的同时检测，包括具有三重螺旋结构的天然胶原和变性胶原。只有变性的胶原蛋白才是导致胶原相关疾病的关键因素，因此，亟需建立针对变性胶原蛋白的高特异性的检测方法。设计合成一种对变性胶原蛋白具有特异性结合能力的新型多肽探针，对癌症、心血管疾病和器官纤维化等众多疾病的检测与疗效评价具有重要意义。

其中，由GPO(Gly-Pro-Hyp)重复序列组成的天然氨基酸多肽，可特异性结合病变胶原蛋白。例如，中国专利CN107266562A公开了一种识别病变胶原蛋白的多肽探针，该探针在GPO的重复序列上修饰荧光物质，在常温条件下容易形成三重螺旋结构。但是，目前特异性结合病变胶原蛋白的多肽探针种类较少。因此，研究制备一种新的识别病变胶原蛋白的多肽探针，可以为胶原蛋白的特异性检测提供更多的选择。

研究发现，羟脯氨酸(Hyp)对于形成健全的胶原蛋白特征序列Gly-X-Y至关重要，其中脯氨酸羟基化导致4R-羟基-L-脯氨酸(Hyp^R)选择性地在胶原蛋白特征序列Gly-X-Y的Y位置发生，作为翻译后修饰，赋予了胶原蛋白特征序列Gly-X-Y额外的稳定性；而且单独地使4R构型的羟脯氨酸有利于形成由水介导的氢键，从而有利于折叠成三重螺旋结构。

但是，在胶原蛋白特征序列Gly-X-Y中，Hyp的设置一般存在如下问题：①由于Hyp除了具有Pro的吡咯环以外也具有一个羟基，所以在合成的时候首先由于空间位阻的存在，并不容易合成；②在X位置，带有C^γ-endo的Pro残基通常稳定三螺旋，而带有C^γ-exo折叠的Pro残基使三螺旋不稳定，而Hyp偏爱C^γ-exo环褶皱，因此会过分增大胶原三螺旋的X位置的扭转角，不利于三螺旋结构的形成；③GOO(Gly-Hyp-Hyp)序列在Ⅰ型胶原蛋白链中几乎不存在，不属于天然胶原蛋白的组成序列，本领域技术人员一般会选择天然氨基酸序列做探针，而不会选择非天然的序列来进行探针的设计。

本发明采用了非天然氨基酸序列GOO，通过固相合成的方法合成了具有GOO重复序列的胶原蛋白质模拟肽。获得的GOO重复序列不仅具有良好的折叠成三股螺旋的能力，而且能够与病变胶原蛋白解链位点进行杂交，能够作为一种新的胶原蛋白杂交肽对病变胶原蛋白进行靶向成像与检测。

发明内容