[发明专利]一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选及鉴定检测的方法

说明书

本发明提供了一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，取来自胆道肿瘤患者的外周血适量置于抗凝离心管中并混匀全血标本；对采集的血样依次进行去除血浆蛋白及血浆核酸、去除红细胞、分层离心、去除白细胞的样品处理；采用HSPG抗体或SDC1亚型抗体或SDC2亚型抗体或GPC1亚型抗体或GPC3亚型抗体结合免疫磁珠捕获HSPG阳性或SDC1阳性或SDC2阳性或GPC1阳性或GPC3阳性的CTC。本发明将HSPG作为胆囊癌以及胆管癌相对特异的CTC分选的功能性肿瘤分子标记，从而提高胆道肿瘤CTC的分选效率，建立一套基于HSPG的CTC分子分型评分体系，获得用于胆道肿瘤高特异度、高敏感度的检测方法，基于高效分选的胆道肿瘤CTC进行下游RNA‑seq、基因NGS检测，获得肿瘤特异性分子信息用于提高特异度。

技术领域

本发明涉及生物与医学检测技术领域，尤其涉及到一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选及鉴定检测的方法。

背景技术

人外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)是指从肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。由于超过90％的癌症死亡是由转移造成的，而CTC是肿瘤转移的直接来源，因此从血液中分离CTC并对其进行分子检测越来越引起人们的重视。

目前CTC的检测已从简单的细胞计数，扩展到下游簇分析、分子分型、基因、转录和蛋白层面检测的各个方向，在乳癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌已进入临床实用，但在胆道癌的诊治上仍有大量的空白。在精准医学时代，血液标志物检测因具有如下的特点及优势，对于肿瘤相关的基因突变检测方法提供了新思路，1.取样简单，可提高随访率；2.可多次检测随访观察，可增加恶性肿瘤检出率；3.无放射性及创伤性损害，可降低并发症的发生率；4.可用于治疗后的复发耐药监测，提高治疗的效率。5.降低检查成本，减轻政府和患者的经济压力，有很高的经济效益比。

硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparan sulfate proteoglycan，HSPG)是由硫酸乙酰肝素链结合在核心蛋白上的一组糖蛋白，在细胞表面和细胞外基质中均有分布，基质HSPG主要与细胞浸润和迁徙有关；胞膜HSPG主要包括Syndecan和Glypican，功能涉及：作为生长因子的共同受体调节信号转导，与粘附分子共同调节细胞迁移，结合调节胞外基质金属蛋白酶活性等。在肿瘤发生与进展时，HSPG的含量、组分和功能出现异常，膜HSPG可与多种生长因子(如FGF、PDGF、EGF、HGF、IGF等)结合，激活相关通路。HSPG总体表达在胆道癌中少有研究，我们已获得的结果包括：对527例胆囊癌组织标本的研究发现，总HSPG主要表达于胆囊癌细胞表面，总HSPG表达阳性率为77.0％(406/527)。在低分化腺癌中HSPG含量升高，细胞分化程度低、伴有局部转移、临床分期晚期的GBC组织中HSPG硫酸化水平升高，硫酸化HSPG阳性患者化疗反应性更差，生存期更短。

循环肿瘤细胞与组织相比，可以实现无创检测，而与血浆中游离的大分子相比，又具有无可比拟的稳定性，因此，具有很大的优势和潜力。本发明将HSPG作为胆囊癌以及胆管癌相对特异的CTC分选的功能性肿瘤分子标记，从而提高胆道肿瘤CTC的分选效率，建立一套基于HSPG的CTC分子分型评分体系，获得用于胆道肿瘤高特异度、高敏感度的检测方法，基于高效分选的胆道肿瘤CTC进行下游RNA-seq、基因NGS检测，获得肿瘤特异性分子信息用于提高特异度。

发明内容

本发明的目的是提供一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选及鉴定检测的方法，将HSPG作为胆囊癌以及胆管癌相对特异的CTC分选的功能性肿瘤分子标记，从而提高胆道肿瘤CTC的分选效率，建立一套基于HSPG的CTC分子分型评分体系，获得用于胆道肿瘤高特异度、高敏感度的检测方法，基于高效分选的胆道肿瘤CTC进行下游RNA-seq、基因NGS检测，获得肿瘤特异性分子信息用于提高特异度。

本发明采用的技术方案如下：一种胆道肿瘤血清中CTC特异性分选的方法，包括如下步骤：