[发明专利]一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法

说明书

本发明公开了一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法，方法包括：通过食蟹猴皮肤建立纤维细胞系，对纤维细胞进行重编程，获得食蟹猴诱导多能干细胞；根据荧光素酶基因设计引物对，荧光素酶基因与引物对进行PCR反应；限制性内切酶对AAVS1载体质粒和PCR反应产物荧光素酶基因片段进行酶切，T4连接酶连接限制酶切后的产物得到重组AAVS1‑荧光素酶质粒，重组质粒插入食蟹猴诱导多能干细胞中；将获得荧光素酶标记基因的细胞和荧光素底物静脉注射进食蟹猴体内后，放入小动物活体成像仪体内进行荧光成像。采用本方法能够无创、有效监测细胞移植后在体内的存活能力、移动位置、分布情况与增殖情况等一系列生物学变化，为大型动物细胞移植的安全性和有效性提供实时性的参考数据。

技术领域

本发明属于细胞移植技术领域，涉及一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法。

背景技术

非人灵长类动物模型与人类在基因水平具有高度相似性，其与患者的症状比啮齿类动物模型和其他动物的症状更为接近，这对于理解疾病的机理，探究新的治疗方法的有效性具有巨大潜力。干细胞治疗已被广泛认为是治疗和治愈复杂疾病的一种新型治疗方法，食蟹猕猴多能干细胞(PSC)在形态，基因表达特征和生长特性方面与人多能干细胞相似，但与小鼠多能干细胞存在差异，这表明猕猴可能是回答某些关键问题的最佳模型。

传统研究细胞的移植效果主要是通过病理组织切片来进行评估,然而,这种方法不适用于监测细胞在活体内的生物学行为。荧光素与底物反应之后，在大动物体内难以通过小动物活体成像仪观察，本专利使用的荧光素酶是一种高灵敏度的新型荧光素酶，将荧光素酶标记的干细胞注射进食蟹猴体内，可有效的观察到干细胞在食蟹猴体内的分布情况与增殖情况，为临床前干细胞治疗提供参考。

生物发光成像技术被应用到细胞示踪领域,不仅可以无创、实时的评价干细胞移植情况,为客观动态评价干细胞在多种疾病治疗中的作用机制及生物学行为提供可能,还可以减少实验动物的数量以及由于实验动物个体差异而引起的误差。荧光素酶是一种具有生物活性的蛋白质,它在活体内无毒、无放射性、可代谢、可透过各种细胞膜和血脑屏障,且不会影响生物体正常生理功能。AAVS1位点是位于人19号染色体上PPP1R12C基因第一个内含子中的一段特定序列,在该区域内引入外源核苷酸序列已被证明不会影响PPP1R12C基因或其他内源基因的表达,并且对细胞的毒性小,是一个经过验证后确保插入靶基因正常转录且不影响邻近基因表达的安全港位点。CRISPR/Cas9系统在靶标基因组位点产生双链断裂位点后,可通过保真度高的同源重组修复将目的基因的敲入。通过核转仪将构建的质粒转入细胞核中，Cas9内切酶切割双链DNA，且有一段具有荧光素酶基因的高度同源的DNA修复模板存在的情况下，生物体内启动修复路径，将荧光素酶基因定点插入食蟹猴干细胞基因内部。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法，包括以下步骤：

(1)通过食蟹猴皮肤建立纤维细胞系，通过重编程小因子对成纤维细胞进行重编程，获得食蟹猴诱导多能干细胞；

(2)根据荧光素酶基因设计引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R；

(3)荧光素酶基因与引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R进行PCR反应；

(4)PCR反应产物进行电泳获得荧光素酶基因片段，然后进行胶回收；使用SalI和MluI限制性内切酶对AAVS1载体质粒和PCR反应产物荧光素酶基因片段进行酶切；

(5)对酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶-1基因片段电泳和胶回收，用T4连接酶连接酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶-1基因片段，得到重组AAVS1-荧光素酶基因质粒；