[发明专利]一种对食蟹猴干细胞荧光示踪的方法

权利要求书

1.一种用于荧光示踪的食蟹猴干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通过食蟹猴皮肤建立纤维细胞系，通过重编程小因子对成纤维细胞进行重编程，获得食蟹猴诱导多能干细胞；

(2)根据荧光素酶基因设计引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R；

(3)荧光素酶基因与引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R进行PCR反应；

(4)PCR反应产物进行电泳获得荧光素酶基因片段，然后进行胶回收；使用SalI和MluI限制性内切酶对AAVS1载体质粒和PCR反应产物荧光素酶基因片段进行酶切；

(5)对酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶基因片段电泳和胶回收，用T4连接酶连接酶切后的产物AAVS1-1载体质粒和荧光素酶-1基因片段，得到重组AAVS1-荧光素酶基因质粒；

(6)将多能干细胞消化成单细胞，再将重组AAVS1-荧光素酶基因质粒与单细胞混合后进行电转；测定核转后的多能干细胞基因序列,确定是否含有荧光素酶基因；电转产物中筛选出荧光素酶标记的细胞，用玻璃针将带有荧光素酶标记的细胞挑出转移到新的培养基中培养，多次传代扩大培养；

所述引物对荧光素酶-F、荧光素酶-R序列为：

荧光素酶-F:5'-ACGCGTCGACGCCACCATGGAGGACGCCA-3'，

荧光素酶-R:5'-CGACGCGTTCACACGGCGATCTTGCCGT-3'。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体积为50μl，扩增程序为:95℃3min；(95℃30s,65℃30s,72℃60s)×40；72℃5min，反应产物保存温度为4℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组AAVS1-荧光素酶基因质粒转化到多能干细胞中方法如下：

(1)重组AAVS1-荧光素酶基因质粒与多能干细胞混合，冰浴5min，42度热激60秒；

(2)快速放入冰浴中2min后加入无抗的LB液体培养基；

(3)将含有多能干细胞的菌液加到对应抗性的LB平板上，均匀涂开培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述LB液体培养基加入量为200ul，所述培养温度及时间为37℃过夜培养。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选荧光素酶标记细胞采用嘌呤霉素。