[发明专利]新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用

说明书

本发明提供了新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用。本发明人克隆获得了新型的黄酮羟基化酶PhF2H、PhF3’H，其属于细胞色素P450羟基化酶，具有对于化合物特定位置进行羟基化的功能。进一步地，本发明人通过对于所述酶的改造、结合运用碳苷糖基转移酶、黄酮前体合成途径的组装，在人工重组表达系统中高效地合成了黄酮碳苷类化合物如荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素，及其合成途径中相关的中间体圣草酚、2‑羟基柚皮素等。

技术领域

本发明涉及合成生物学及医药技术领域，具体地，本发明涉及新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物或其中间体的微生物、其制备方法及其应用。

背景技术

竹自古以来作为一种药食两用的植物在民间广为流传。《中药大辞典》记载“竹叶清热除烦，生津利尿”指明竹叶的食用价值；而《文经逢源》记载：“竹叶兼行肌表，能疗疮杀虫”亦标明其外用药效；竹叶在江南地区作为一种清热败火茶饮而广为流传。竹叶中最主要的黄酮提取物为四种碳苷黄酮化合物：荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素。

碳苷类黄酮化合物是以黄酮C6-C3-C6结构为母核，糖基直接与母核以C-C键相连的化合物。碳苷类黄酮相对于氧苷类黄酮更为稀有，迄今为止从自然界中分离到的碳苷黄酮有几十种，按照黄酮的母体结构可分为碳苷黄酮类、黄酮醇碳苷类、双碳苷黄酮类化合物，而其中以碳苷黄酮类化合物存在最为广泛。根据报道，碳苷黄酮类化合物具有显著的抗氧化作用，可以显著性抑制外源性以及内源性自由基；同时，其具有一定程度抑制细菌病毒的作用；碳苷黄酮类化合物也具有调节血脂的作用，可以显著性地降低血液中总胆固醇的含量，并且具有治疗心脑血管疾病的药物活性；同时碳苷黄酮类化合物具有显著性抗辐射以及神经保护的作用；有调查表明碳苷黄酮类化合物具有相关抗代谢疾病的作用，对于糖尿病、肥胖等疾病均具有一定的治疗效果。

与大多数天然产物一样，几种碳苷黄酮化合物的通过化学有机合成的方法十分困难。现阶主要段获得依从植物中进行有机试剂萃取的方法。在此过程中需要大量的有机溶剂，还存在随后的分离工艺繁琐，工业化造价高等问题。最主要的是该方法还会遇到植物生长缓慢的瓶颈问题。

现阶段随着合成生物学的发展，利用微生物作为底盘细胞，通过外源基因的导入以及微生物反应器发酵手段定向合成目标产物为越来越普遍的一种技术。微生物具有遗传操作简便、生长迅速等优势。相对于传统的植物提取手段，微生物发酵具有速度快、受天气气候影响较小等优势，并且一些中间产物更易获得；部分化合物通过微生物合成的产量远高于植物提取，已经成为天然产物获得的一种重要手段。

目前，尚无于大肠杆菌中高效合成碳苷黄酮化合物的报道，因此本领域亟待进行有效的探索，以期找到此类化合物的高效合成途径。

发明内容

本发明的目的在于提供新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物或其中间体的微生物、其制备方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种催化黄烷酮(类)化合物的C-2位或C-3’位羟基化的方法，包括：以新型黄酮羟基化酶进行所述催化；其中，所述新型黄酮羟基化酶为SEQ IDNO:1所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-2位羟基化；或所述新型黄酮羟基化酶为SEQ ID NO:2所示的多肽或其保守性序列变体，其催化黄烷酮(类)化合物的C-3’位羟基化。

在一个优选例中，所述黄烷酮(类)化合物具有式(I)的母核结构，C-2位羟基化后形成式(II)母核结构(开环形式)的化合物，C-3’位羟基化后形成式(III)母核结构的化合物；

在另一优选例中，A环或B环中，存在1、2或3个羟基。

在另一优选例中，所述的黄烷酮(类)化合物包括(但不限于)：柚皮素，圣草酚，松属素，橙皮素，樱花素。