[发明专利]基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法及其应用

说明书

本发明公开一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，通过基因工程构建两种工程菌，使SUMO标签N端与一种菌的膜锚定蛋白融合，SUMO标签C端与目的蛋白融合，同时将Ulp1蛋白酶融合到另外一种菌的膜锚定蛋白上，再将两种工程菌诱导表达后离心，重悬到缓冲液并混合孵育，Ulp1蛋白酶会将目的蛋白从SUMO标签上切割下来并溶于缓冲液中，菌体及其表面锚定的SUMO和Ulp1可通过离心去除，而上清中即为纯化的目的蛋白。该纯化方法不需要破碎菌体以及层析步骤，仅通过“菌体孵育‑离心”两步就可以达到提纯蛋白的目的，该方法具有快速、简便的特点，还能得到不含任何冗余序列的天然蛋白分子，具有广泛的推广价值和应用前景。

技术领域

本发明涉及基因和蛋白工程领域，特别是涉及一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法及其应用。

背景技术

利用基因工程和蛋白质工程技术在表达宿主体内制备和获取重组蛋白是目前应用十分广泛的技术。其中，蛋白质的纯化是一项较为耗时且繁琐的步骤，例如：最常用的大肠杆菌原核表达系统，蛋白质在细菌体内大量诱导表达后，首先需要将菌体破碎，然后通过离心收集上清液或者包涵体沉淀，再进行下一步的提纯；提纯步骤往往涉及盐析、离子交换、分子筛或亲和层析等方法。亲和层析虽然能够一次纯化得到目的蛋白，但需要在目的蛋白中加入“亲和标签”，所以要得到天然序列的蛋白，还需要将标签切除并再次纯化。

目前已有一系列快速简便的蛋白纯化方法被报道。比如：给目的蛋白加上信号肽，蛋白表达后可以分泌到细胞外面，可以省去菌体破碎的步骤，但后续仍需将目的蛋白从培养基中提纯；还有将目的蛋白与“自聚合标签”融合，融合蛋白表达后首先形成沉淀，再通过对沉淀进行酶切，将目的蛋白与沉淀标签分离后得到纯化蛋白。此方法虽然无需层析步骤，但仍需要先将菌体破碎。

SUMO标签是一种小分子的类泛素化蛋白，分子量大小只有11kD左右，常被融合在目的蛋白的N末端来提高蛋白的表达量和溶解度。此外，SUMO标签可以被蛋白酶Ulp1识别、切除，并且不会在目的蛋白中留下任何冗余的氨基酸残基。这样使得SUMO标签比其他蛋白标签的移除更加有效便捷，是一种理想的蛋白融合标签。而目前没有利用SUMO标签与标签酶Ulp1相互间的作用关系进行蛋白纯化的相关报道，而为了改进现有纯化蛋白技术中所存在的缺陷，利用SUMO标签与标签酶Ulp1相互作用的优势发明一种新的纯化蛋白的方法，将对解决现有技术问题产生极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，改变现有的纯化蛋白方法繁琐过程，不需要破碎菌体以及层析步骤，仅仅通过“菌体孵育-离心”两步就可以达到提纯蛋白的目的，该方法具有快速、简便的特点，具有广泛的应用前景。

本发明还有一个目的是提供一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法在蛋白纯化方法的应用，具体应用于红色荧光蛋白的纯化中，验证了该方法纯化提纯过程的快速简便方式，以及所得到的目的蛋白不带有任何标签，纯化度高。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种基于膜表面融合表达策略纯化蛋白的方法，通过基因工程构建两种工程菌，使SUMO标签N端与一种菌的膜锚定蛋白融合，而SUMO标签C端与目的蛋白融合，同时将Ulp1蛋白酶融合到另外一种菌的膜锚定蛋白上，再将两种所述工程菌诱导表达后离心，重悬到缓冲液并混合孵育，离心后上清中即可得到目的蛋白。

优选的是，具体包括以下步骤：

步骤1：合成表达大肠杆菌前脂蛋白信号肽Lpp、跨膜蛋白OmpA、SUMO标签序列的融合蛋白序列的编码基因lpp-ompA-sumo，并将所述lpp-ompA-sumo克隆到pET-28b线性载体，连接产物转入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到SUMO融合蛋白膜表面表达载体pET-LO-SUMO；