[发明专利]一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种丝状真菌外泌体的提取方法；该方法包括如下步骤：用LNAAM培养基发酵丝状真菌，得到含有此丝状真菌外泌体的发酵液；将此发酵液去除菌丝，然后进行高速离心去除不溶性杂质，保留上清；接着使用超滤离心管进行低温超滤浓缩，使用适量PBS溶液清洗浓缩液三次；然后使用外泌体纯化柱进行纯化；最后使用0.22μm过滤器进行过滤除菌即得到真菌外泌体；该方法可快速高效地从丝状真菌发酵液中提取到高纯度、高浓度的外泌体；同时，本发明还公开了一种丝状真菌外泌体在线虫生物防治领域的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用。

背景技术

外泌体(exosomes)是一种细胞分泌的微小膜泡，具有30-200nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。它通过其膜上运载的蛋白质、RNA、脂类等信号分子，以及膜内包裹的内含物(神经递质、蛋白、激素和细胞因子等)在细胞间通讯和机体调控中发挥至关重要的作用。近年来，外泌体凭借其大小及双分子膜等优势在参与细胞间通讯、疾病诊断、疾病治疗等方面发挥重要作用。几乎所有的细胞都可以产生外泌体，不同细胞来源的外泌体中既包含与细胞形成、结构和物质转运相关的共有成分，也包含与来源细胞的生物功能相关的特异分子。外泌体作为一种细胞间交流、传递生物功能分子的重要方式日益受到重视。

丝状真菌因在人体健康、生物医药、工业发酵、农业生产以及环境保护等方面具有独特的作用，发挥了日益重要的角色。对人类有致病性的真菌约有300多个种类，能引起浅表真菌病、皮肤真菌病、皮下组织真菌病和系统性真菌病等多种感染性疾病。许多丝状真菌产生临床需要的抗生素、抗肿瘤药物、降脂药物与免疫调剂等药物，是治疗多种人类疾病的重要手段；丝状真菌通过工业发酵产生人类广泛使用的生物活性物质、工业用酶与功能蛋白的重要来源。在农业生产和环境保护领域，丝状真菌对许多重要经济作物种植和动物养殖影响巨大，是许多动植物的致病菌之一；作为生态环境中普遍存在的生物种群，丝状真菌可以分解消耗大部分有机物质，对生态系统的物质能量循环具有重要作用。除此之外，丝状真菌在其他方面也深刻得影响着我们的生活。例如，建筑物腐蚀、水质污染等多数都和真菌有关。

目前，对丝状真菌外泌体的研究和开发目前处于空白领域。丝状真菌外泌体将会在真菌感染性疾病的诊断、抗真菌药物靶点及其药物开发、工业发酵真菌调控、植物保护与动物保健等领域具有潜在应用价值。本研究将提供一种通用的丝状真菌外泌体的制备方法，并且证明了其在植物线虫病害的生物防治领域的应用。

植物寄生线虫会引起植物病害，是植物主要病原之一。在我国，根结线虫、松材线虫和包囊线虫是主要植物寄生线虫病害，导致作物大量的减产，严重限制了我国农林业的发展。而丝状真菌少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)是一类捕食线虫真菌，属于子囊菌门，在普通环境中营腐生生活，但是当在周围环境中存在线虫时该丝状真菌通过营养菌丝体特化形成三维菌网来捕食线虫。

当前，对线虫的防治主要依靠化学杀虫剂，在短时间内能起到杀线虫效果，但长期使用化学杀虫剂会造成环境污染，同时杀虫剂残留会进一步影响到动植物，甚至是人类自身健康。近年来，生物防治线虫得到了各国政府的重视，从不污染环境、经济实惠目标着手开展了各项试验项目，众多的研究结果证明，利用线虫的自然天敌-捕食线虫性真菌进行生物防治是防控线虫的一种安全有效的方法。丝状真菌少孢节丛孢菌(Arthrobotrysoligospora)的外泌体将在生物防治线虫中起到关键作用，是一类新型的线虫生物防治制剂。

因此，发明一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用来解决上述问题很有必要。

发明内容

本发明结合现有提取外泌体的技术，从节约成本、省时、高纯度等方面出发综合优化，提供了一种快速提取丝状真菌少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)外泌体的方法；同时证明了其在植物线虫病害的生物防治领域的应用。具体内容如下。