[发明专利]一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用

权利要求书

1.一种丝状真菌外泌体提取方法，包括如下步骤：

步骤1：用LNAAM液体培养基培养丝状真菌，其中LNAAM液体培养基含有以下成分：MgSO₄·7H₂O(0.2mg/ml)、KCl(1mg/ml)、FeCl ₃·6H₂O(0.03mg/ml)、ZnSO₄·7H₂O(0.88μg/ml)、MnSO₄·H₂O(0.3μg/ml)、thiamin-HCl(2μg/ml)、biotin(0.05μg/ml)和200×氨基酸(0.5ml/100ml)，将200×氨基酸：2g赖氨酸(Lys)，2g缬氨酸(Val)，2g苯丙氨酸(Phe)，1g脯氨酸(Pro)，1g甘氨酸(Gly)，1g丙氨酸(Ala)，0.1g精氨酸(Arg)，0.1g半胱氨酸(Cys)，0.1g亮氨酸(Leu)，0.1g组氨酸(His)，0.1g甲硫氨酸(Met)，0.1g酪氨酸(Tyr)，0.1g谷氨酸(Glu)，溶于ddH2O中，定容至100ml，0.22μm水系滤器过滤除菌，存于4℃；加入孢子培养，得到含外泌体的发酵液；

步骤2：将所述发酵液进行去除菌丝处理，然后进行高速离心处理，保留上清液；

步骤3：将所述离心上清液用超滤离心管进行超滤浓缩，然后使用适量PBS溶液清洗浓缩液三次；

步骤4：将所述浓缩液使用外泌体纯化柱进行纯化，得外泌体纯化液；

步骤5：将所述纯化液使用0.22μm过滤器进行过滤除菌处理。

2.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述高速离心的转速为8000-12000rpm，所述超滤离心的转速为2000-5000rpm。

3.根据权利要求2所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述超滤离心管的MWCO范围为100KD-250KD。

4.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述超滤离心浓缩处理的条件为：转速为3000rpm，时间为8min。

5.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述外泌体制备培养基为含双抗(1％青霉素/链霉素)的LNAAM培养基。

6.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述LNAAM培养基发酵丝状真菌，发酵温度为25-28℃，发酵时间为1-10天。

7.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述的丝状真菌为丝状真菌的孢子或菌丝体，培养温度为25-28℃。

8.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述去除菌丝处理为将发酵液使用3层至8层无菌擦镜纸、滤纸或纱布进行过滤处理。

9.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述外泌体纯化方法是使用外泌体纯化柱进行纯化，其超滤膜的MWCO为300KD-1000KD；其转速为3000rpm。

10.权利要求1-9任一项所述的一种丝状真菌外泌体的应用，其特征在于：所述丝状真菌外泌体具有抑制线虫运动的活性，具有在线虫生物防治领域的应用价值。