[发明专利]游离D型氨基酸的富集检测方法

权利要求书

1.游离D型氨基酸的富集检测方法，其特征包括以下步骤：

S1、待测样品制备；

S2、待测样品中氨基酸的富集；

采用强阳离子固相萃取柱，用含0.1％甲酸的10mL甲醇洗柱；加入茶汤30mL过柱；分别用5mL 0.1％的甲酸水溶液和5mL甲醇淋洗，最后用3mL 5％氨水进行洗脱，洗脱液在40℃下氮气吹干后用1mL水溶解残留物作为分析样品；

S3、待测样品中氨基酸对映异构体的拆分；

S4、待测样品中氨基酸的鉴定与定量；

所述步骤S3和S4中D-氨基酸和L-氨基酸的拆分与检测采用手性液相-质谱分析方法，分析条件如下：

液相条件：

手性色谱柱：4.6mm i.d.,250mm 5μm的Astec CHIROBIOTIC T；

流动相：A：含0.02％甲酸的水B：含0.02％甲酸的甲醇；

流速0.8-1.2mL/min；进样量20μL；柱温：30℃；梯度洗脱；

质谱分析条件选择A或B：

A、四级杆-飞行时间质谱分析条件：ESI+电喷雾正离子扫描模式，氮气用作干燥气，毛细管电流5.324μA，腔电流7.37μA，离子传输毛细管温度200℃，流速设置为8L/min，脱溶剂温度200℃，雾化气压设置为35psig，碰撞电压175V，锥孔电压65V，鞘气温度200℃，扫描速率2spec/s；一级MS质量范围设定为m/z 50-300，通过上述优化质谱参数得到响应最大的分子离子峰作为母离子，接着在MSMS模式下，通过优化碰撞能量使其子离子的响应最大化；二级MSMS质量范围设定为m/z 42-240；

B、三重四级杆质谱分析条件：ESI+电喷雾正离子离子源，氮气用作干燥气，毛细管电流5.324μA，腔电流7.37μA，离子传输毛细管温度200℃，流速设置为8L/min，脱溶剂温度200℃，雾化气压设置为35psig，碰撞电压135V，锥孔电压65V，鞘气温度200℃，扫描速率2spec/s；一级full scan质量范围设定为m/z 50-300，随后进行product ion模式对母离子进行子离子扫描，通过上述优化碰撞能量使其子离子的响应最大化，采用MRM多反应监测模式，对DL-氨基酸进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的游离D型氨基酸的富集检测方法，其特征在于，所述流动相的洗脱条件如下：

3.根据权利要求1所述的游离D型氨基酸的富集检测方法，其特征在于，待测样品制备步骤如下：

(1)茶样制备：将茶叶用研磨机磨粉得干茶粉；

(2)茶汤的冲泡：取干茶粉1.5g，加入30mL沸水，在90℃水浴中保温10分钟后，过滤，冷却至室温；茶汤用6M甲酸调至pH 2.8。

4.根据权利要求1所述的游离D型氨基酸的富集检测方法，其特征在于，所述DL-氨基酸包含DL-异亮氨酸、DL-亮氨酸、DL-缬氨酸、DL-酪氨酸、DL-谷氨酸、DL-色氨酸、DL-苏氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-甲硫氨酸、DL-丙氨酸、DL-丝氨酸、DL-天冬氨酸、DL-半胱氨酸、DL-谷氨酰胺、DL-天冬酰胺、DL-脯氨酸、DL-赖氨酸、DL-精氨酸、DL-组氨酸及DL-茶氨酸。