[发明专利]用于生物荧光芯片的自动对焦方法

说明书

本发明公开了一种用于生物荧光芯片的自动对焦方法，包括以下步骤：自适应窗口选取；自适应阈值选取；计算离焦距离和离焦方向；实现样本对焦。本发明根据微孔式PCR芯片的微孔及排列特征自适应的选择及调整窗口位置，以保证对焦对象及其边界区域位于对焦窗口内；根据对焦对象亮度的高低自适应的调整阈值，变化的阈值给后续不同亮度的样本在其对焦曲线的一致性上奠定了基础；本发明得出了微孔式数字PCR芯片荧光图像随离焦距离的变化、其大于阈值的像素数的变化曲线及其分段函数后，根据分段函数及方向判别方法，只需3个位置的荧光图像，即可得出离焦距离和离焦方向，再需一步即可完成对焦，整个过程仅需4步完成对焦。

技术领域

本发明涉及生物成像领域，特别涉及一种用于生物荧光芯片的自动对焦方法。

背景技术

数字聚合酶链反应(Digital polymerase chain reaction，dPCR)是一种测量靶DNA绝对拷贝数的独特方法，是一种绝对定量技术，最早由Saiki等发表在文章里，与实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR Detecting Syste,即qPCR)相比，dPCR已被证明具有更高的灵敏度，精度及重复性。从扩增后的dPCR芯片中获取到有用的信息依赖于dPCR检测分析系统，如进行无创产前检测，人类乳腺癌中HER2癌基因的检测等。目前，dPCR荧光信息的检测方式主要包括两种：一是荧光成像，二是流式细胞荧光分选。荧光成像技术随着相机成像技术的发展，其成像速度越来越快，分辨率也越来越高，这种成像方式在显微成像中得到越来越广泛的应用。

而相机成像存在失焦的问题，特别是像dPCR这样，需要通过处理得到的图像数据来获得生物信息数据，若图像离焦问题严重，则会影响统计数据的准确性。不同样本之间垂直位置的差异性，导致相机获得的图像呈现不同程度的模糊，因此，对焦在光学视觉成像系统中起着重要作用，例如各类相机，扫描仪，显微镜。而自动对焦优势体现在：可以在最少的人工干预下获得清晰图像，进而获得准确的统计数据。为了快速获取清晰的图像以便于后续数据处理得到准确的检测结果，必须根据样品变化动态的改变样品与物镜或物镜与成像面之间的距离，以实现样品的自动对焦。

自动对焦可以通过主动、被动或者两者混合来实现。主动方法一般是通过激光等测距工具来测量离焦距离后进行对焦。主动方法需要在系统中额外嵌入测距系统，并且当使用激光时，会造成基因芯片上的荧光基团淬灭，对后续数据的准确性造成影响。被动方法可以分为相位检测法和对比度检测法，前者通过测量两幅图像之间的相位差来估计聚焦位置，依赖于特殊的传感器检测系统；后者计算每一帧的清晰度以寻找最佳位置，无需额外检测附件，精简整体系统，降低成本，但搜索每一帧并计算，明显增加了计算量和搜索步骤，造成对焦时间延长。

微孔式数字PCR芯片面积大，通量高，弱荧光样本分布差异造成其计算对象存在片内差异与片间差异，若对焦方法不当，荧光基团长时间暴露在激发光下会发生淬灭，会影响后续结果统计。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于生物荧光芯片的自动对焦方法。

考虑到微孔式数字PCR芯片面积大，通量高，弱荧光样本分布差异造成其计算对象存在片内差异与片间差异，若对焦方法不当，荧光基团长时间暴露在激发光下会发生淬灭，影响后续结果统计,为了实现快速准确对焦，本发明基于dPCR芯片多个排列孔的特征，提出了一种新的对焦算法，单曲线拟合函数法，通过计算包含单个孔的区域内大于阈值的像素的个数，得到随离焦距离变化，该区域内大于阈值的像素数变化曲线。在这里，阈值随图像平均灰度的变化而变化，从而得到一条与图像灰度无关的像素数随离焦距离变化曲线，通过正弦函数拟合得到该曲线的拟合函数，即为微孔式dPCR芯片的对焦评价算法。通过该对焦算法，可以快速的得到离焦图像的离焦距离与离焦方向，进而快速而准确的完成对焦。

本发明采用的技术方案是：一种用于生物荧光芯片的自动对焦方法，包括以下步骤：

1)取相，选择一个窗口区域的图像；