[发明专利]一种高油抗逆牡丹选育方法

权利要求书

1.一种高油抗逆牡丹选育方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)高油基因遗传稳定性筛选

以序列表中SEQ ID No.1-2、3-4、5-6、7-8和9-10所示的核苷酸序列为引物对牡丹ABI、WRI、SAD、FAD2和 FAD3基因进行实时荧光定量RT-qPCR，检测表达量；

(2)抗性基因遗传稳定性筛选

以序列表中SEQ ID No.11-12、SEQ ID No.13-14和SEQ ID No.15-16所示的核苷酸序列为引物对DREB2A、WRKY19和XET基因启动子序列进行克隆；然后以该克隆为模板，以序列表中SEQ ID No.17-18、SEQ ID No.19-20和SEQ ID No.21-22为引物对抗逆基因启动子功能元件特征片段进行扩增并用于重组启动子植物表达载体的构建，将构建的重组启动子植物表达载体转入模式材料进行抗性响应鉴定；

所述抗性基因遗传稳定性筛选包括：

a.DREB2A、WRKY19和XET基因启动子序列的克隆

提取牡丹基因组DNA；对DREB2A、WRKY19和XET基因启动子序列进行PCR扩增，所述PCR反应体系50μl，其中牡丹基因组DNA模板200ng，5U/μl TaKaRa LA Taq0.5μl，10×LATaqBufferⅡ5μl，2.5mM each dNTP Mixture 8μl，10pmol·μL^-1上游引物1μl，10pmol·μL^-1下游引物1μl，剩余由ddH₂O补足；反应条件为1cycle：94℃，5min；35cycles：94℃，30s、52℃，30s、72℃，2min；1cycles：72℃，5min；将PCR产物克隆，提取质粒备用；

b.重组启动子植物表达载体的构建

以步骤a获得的质粒为模板,对抗逆基因启动子功能元件特征片段进行PCR扩增；所述PCR反应体系50μl，其中质粒模板200ng，5U/μl TaKaRa LA Taq0.5μl，10×LA Taq BufferⅡ5μl，2.5mM each dNTP Mixture 8μl，10pmol·μL^-1上游引物1μl，10pmol·μL^-1下游引物1μl，由ddH₂O补足体系；反应条件为1cycle：94℃，5min；35cycles：94℃，30s、52℃，30s、72℃，2min；1cycles：72℃，5min；回收PCR产物；

将植物表达载体酶切，回收酶切产物与抗逆基因启动子功能元件特征片段重组，选择重组成功的重组启动子植物表达载体备用；

c.重组启动子植物表达载体遗传转化

将构建好的重组启动子植物表达载体转入模式材料叶片；

d.胁迫处理

将步骤c获得的转基因模式材料培养后进行胁迫处理，所述胁迫处理为以下处理的一项或多项：

①培养基中含有2％PEG6000，

②培养基中含有200mmol·L^-1NaCl，

③4℃条件下培养，

④培养基中含有100μmol·L^-1ABA；

e.GUS荧光定量检测

荧光反应大的重组启动子元件对抗性胁迫响应敏感，其来源为本次筛选的最佳抗性材料。

2.根据权利要求1所述的高油抗逆牡丹选育方法，其特征在于，所述高油基因遗传稳定性筛选包括：

a.提取牡丹籽胚乳组织RNA，反转录获得cDNA序列；

b.以RT-qPCR方法对牡丹ABI、WRI、SAD、FAD2和/或FAD3基因扩增；RT-qPCR反应体系包括200ng/μl cDNA模板2μl，2×qPCR Master Mix10μl，10μl mol/L的上游引物和下游引物各0.8μl，50×ROX Reference Dye II0.4μl，剩余量由ddH₂O补齐，总体系25μl；反应条件为95℃，2min预变性；95℃，15s；60℃，60s，共40个循环；

c.荧光分析在65℃以0.5℃/s速度上升至95℃过程中进行，通过荧光分析检测牡丹籽油合成基因ABI、WRI、SAD、FAD2和/或FAD3的表达量，筛选表达量相对较高的牡丹品种作为高油牡丹。