[发明专利]一种复合固定化菌剂及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种复合固定化菌剂的制备方法，其特征在于，所述固定化菌剂的制备方法包括以下步骤：

(1)制备石油烃降解菌的菌悬液；其中，所述石油烃降解菌为假单胞假碱菌、固氮假单胞菌、威尼斯不动杆菌及鞘氨醇单胞菌中的三种或四种的组合，且每种石油烃降解菌的用量相同；

(2)向所述菌悬液中加入生物炭，并混合均匀以使石油烃降解菌充分吸附到生物炭上，得到生物炭-菌液混合液；

步骤(2)中，以配制菌悬液所用的NaCl溶液及配制海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液所用的NaCl溶液的质量之和为100％计，所述生物炭的质量浓度为1％-5％；

(3)将海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液与所述生物炭-菌液混合液混合均匀，以使海藻酸钠、聚乙烯醇和生物炭之间进行交联固定化，再将所得混合液逐滴滴加到CaCl₂-硼酸溶液中，以NaCl水溶液对所得混合液进行清洗后，将混合液置于无菌培养基平板上，自然晾干，得到海藻酸钠-聚乙烯醇-生物炭复合固定化菌剂；

所述海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液按照以下步骤制得：

将海藻酸钠及聚乙烯醇于NaCl水溶液中溶解均匀，于121℃灭菌20分钟后，得到所述海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液，以配制NaCl水溶液所用蒸馏水的总重量为计算基准，所述NaCl水溶液的质量浓度为0.9％；

步骤(3)中，以配制菌悬液所用的NaCl溶液及配制海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液所用的NaCl溶液的质量之和为100％计，海藻酸钠的浓度为1％-5％，聚乙烯醇的浓度为1％-3％；

以配制菌悬液所用的NaCl溶液及配制海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液所用的NaCl溶液的质量之和为100％计，所述CaCl₂-硼酸溶液的质量浓度为2％-4％；

步骤(3)中，海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液与所述生物炭-菌液混合液的体积比为1:1-2:1；

步骤(3)中，以配制NaCl水溶液所用蒸馏水的总重量为计算基准，所述NaCl水溶液的质量浓度为0.9％。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述制备石油烃降解菌的菌悬液，包括：

将石油烃降解菌接种于LB液体培养基中，培养至对数生长期后，用无菌的NaCl水溶液洗涤，再加入NaCl水溶液，得到菌悬液。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，以所述LB液体培养基的总体积计算，所述石油烃降解菌的接种量为1‰。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，以配制NaCl水溶液所用蒸馏水的总重量为计算基准，所述NaCl水溶液的质量浓度为0.9％。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述LB液体培养基按照以下步骤制得：

称取10g的NaCl，10g的胰蛋白胨，5g的酵母浸粉，加入到1L蒸馏水中溶解，将所得混合液的pH值调至7.2-7.4后，于121℃灭菌20min，得到LB液体培养基。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生物炭是以麸皮为原料，于300±10℃裂解2-3h后制得。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，混合均匀所需时间为2-3h。

8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述CaCl₂-硼酸溶液按照以下步骤制得：

向蒸馏水中加入CaCl₂，再加入一定量的硼酸调节pH至6.8，得到所述CaCl₂-硼酸溶液。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，交联固定化时间为15-30min。

10.权利要求1-9任一项所述复合固定化菌剂的制备方法制备得到的复合固定化菌剂。