[发明专利]一种石榴玻璃化试管苗恢复培养基和培养方法

说明书

本发明涉及一种石榴玻璃化试管苗恢复培养基和培养方法。本发明的石榴玻璃化试管苗恢复培养基专门针对石榴玻璃化试管苗，可使90％以上的石榴玻璃化试管苗恢复为正常壮苗，并实现增殖系数达到2.6～4.7，是一种实用高效的培养基。本发明依次采用依次采用紫光+中性光混合培养、中性光培养进行石榴玻璃化试管苗的培养，其中光培养阶段采用夹层培养，紫光培养能够调节隐花色素的比例、促进合成叶绿素，加速蛋白质合成、抑制徒长；LED中性光中红光光谱比例大，既促进壮苗形成又克服了单色光照射引起的生长弊端，夹层培养克服了培养容器上下产生温度差和内部产生水珠等不利生长的因素。

技术领域

本发明涉及一种石榴玻璃化试管苗恢复培养基和培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

组织培养技术是生物技术育种、转基因工程和遗传转化等技术手段的基础和关键，作用极为重要。在植物组培过程中，玻璃化现象非常普遍，表现为试管苗透明或半透明、绿色水浸状，生长缓慢，叶片细长且卷曲，质地瘫软或脆弱易碎，生命活力降低，不易生根或移栽、难成活。玻璃化试管苗的研究始于20世纪60年代，最早是英国人PHILLIPS等在草本观赏植物石竹茎尖培养过程中发现的，DEBERGH等在1981年提出“玻璃化”一词，随后越来越多的学者投入玻璃化现象的研究之中，对其发生原因、发生特点、预防措施等深入研究并取得很大进展。

21世纪初，整个植物界(包括草本植物和木本植物)发生玻璃化现象的物种数量超过70个。近年来以组织培养为手段的生物技术研究不断深入和发展，产生玻璃化试管苗的物种数量也越来越多。2016年课题组对国内已报道的出现玻璃化试管苗的果树种类做了统计，包括草本果树(如蓝莓)、木本果树(如苹果)、落叶果树(如梨)和常绿果树(如香蕉)等，数量已超过50种。

玻璃苗的出现，与母株或再生植株受到盐分胁迫、气体胁迫、温度胁迫、亚铁胁迫、水分胁迫或光胁迫等诸多因素有关；此外，还受季节、空气湿度以及培养架结构是否通风散热良好等因素的影响。即使在技术成熟的植物初代和继代培养过程中，玻璃化现象也会不定时地、突发性地出现，最严重时发生比例会超过50％，浪费生产资源、损失珍贵科研材料，经济、科研和生态损失不可估量。

石榴(Punica granatum L.)为石榴科石榴属多年生落叶果树，在生物技术领域，很多优良品种不仅建立了茎段、胚、叶片和花药等的再生体系，有些还培育出了四倍体植株。笔者从事石榴组织培养工作多年，相继建立了多个品种的茎段和叶片再生体系，石榴再生过程均表现良好。但是，笔者发现石榴试管苗仍会不定时地、偶发性地出现玻璃化现象，比例因季节和品种而异，通常夏季春季秋季和冬季，品种‘皮亚曼’‘三白酸’‘泰山红’‘牡丹’，比例高时会达到43％。石榴玻璃化苗的恢复培养技术，能够减少科研和生产中的损失，并对增加转基因植株的遗传稳定性、保存和恢复珍贵材料无性系、提高次生代谢物产量和消除毒性以及工厂化育苗都具有十分重要的意义。

玻璃化试管苗恢复过程中，试管苗会产生一系列生理变化，包括叶绿素的合成、光合机构的形成、新芽的生成等，涉及分化、发育和物质运输等多种生理学现象。光照的有无、强度以及光质等对黄化试管苗恢复具有极其重要的作用。

在培养基中补充足够浓度的N、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、B、K、钼等元素时，有利于玻璃化苗的恢复。番茄叶面喷施磷酸二氢钾可显著提高叶绿素含量及净光合速率。