[发明专利]一种分泌型的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系的构建方法

说明书

本发明公开了一种分泌型的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系的构建方法，本发明将含有目的基因SV40LT外源性表达载体转染到奶山羊乳腺上皮细胞，构建转基因的奶山羊乳腺上皮细胞系；荧光显微镜观察标记基因copGFP的表达情况，并经Puromycin筛选获得阳性细胞，并进行PCR鉴定证实目的基因SV40LT整合到奶山羊乳腺上皮细胞的基因组。本发明所构建的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系具有无限传代的功能，且能维持奶山羊乳腺上皮细胞的特性，具有合成和分泌蛋白的功能；在传代过程中能够保持核型正常，不存在染色体结构和数目的变化；而且，该崂山奶山羊乳腺上皮细胞系对革兰氏阴性菌具有易感性，可以用于构建炎症反应的动物模型，以用于相关疾病的研究。

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，具体涉及一种分泌型的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系的构建方法。

背景技术

在小反刍动物的饲养管理中，乳房炎是一种常见的疾病。在奶牛养殖中最为常见，近年来随着羊奶的价值不断发现，奶山羊养殖业也得到迅速发展，但乳房炎问题同样也日显突出，给奶山羊养殖业带来的损失十分严重。首先乳房炎对奶山羊饲养业造成了严重的经济损失，其次奶山羊乳房对奶及其制品的品质也有影响。除此之外，同奶牛一样乳房炎也会导致奶山羊经济利用的年限大大缩短，奶山羊乳房炎也对消费者存在潜在的生物安全风险。尽管抗生素的疗法能够有效的控制乳腺炎的发生，但是细菌的变异、抗生素的残留已经严重危害人类和动物的安全。因此，奶山羊乳腺上皮是研究的必要工具。但由于奶山羊乳腺上皮细胞的原代培养中需要对泌乳期的健康奶山羊进行乳腺组织摘除，要消耗大量的时间和财力，加上乳腺上皮细胞原代培养步骤繁琐且传代次数少，给研究带来极大的不便。所以，通过建立分泌型奶山羊乳腺上皮细胞系并利用动物乳腺生物反应器技术来生产具有乳房炎抗性的相关细胞因子对于动物的生产具有重要的意义。

在前期细胞系的建立方法中，传统的电穿孔法和脂质体法导入端粒酶和SV40大T抗原到宿主细胞是两种最常见的方法。端粒酶是基于端粒的延长从而达到细胞系构建的目的，但转染效率低，且稳定性差，易丢失。而SV40大T抗原是使细胞向肿瘤化转变从而达到细胞系的构建条件稳定性高，不易丢失；但SV40大T抗原方法构建的细胞系在长期传代的过程中，可能会伴有核型的改变。电穿孔法和脂质体法转染时操作相对简单，但对细胞损伤较大且转染效率低，适合瞬时转入外源基因，不适合构建稳定的细胞系。

另外，由于乳腺上皮细胞是一种高度分化的细胞，其培养条件较为苛刻，比如模拟正常泌乳的生理条件和激素环境，才能使转染的基因有效表达。在体外培养过程中，乳腺上皮细胞往往发生脱分化，必须采用合适的处理方法使细胞恢复或保持在分化状态。因此，目前关于动物乳腺上皮细胞系的报道不是很多。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种分泌型的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系的构建方法。本发明所构建的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系具有无限传代的功能，且能维持奶山羊乳腺上皮细胞的特性，具有合成和分泌蛋白的功能；在传代过程中能够保持核型正常，不存在染色体结构和数目的变化；而且，该崂山奶山羊乳腺上皮细胞系对革兰氏阴性菌具有易感性，可以用于构建炎症反应的动物模型，以用于相关疾病的研究。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种分泌型的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系的构建方法，包括以下步骤：

(1)获得崂山奶山羊乳腺上皮细胞，并在培养液中进行培养；

(2)以pCDH-CMV--MCS-SV40LT-copGFP-P2A-Puro作为慢病毒载体，以psPAX2和pCMV-VSV-G作为辅助包装载体，共同转染293T细胞，获得慢病毒颗粒；