[发明专利]一种分泌型的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系的构建方法

权利要求书

1.一种分泌型的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系，其特征在于，由如下方法构建而成：

（1）获得崂山奶山羊乳腺上皮细胞，并在培养液中进行培养；

（2）以pCDH-CMV--MCS-SV40LT-copGFP-P2A-Puro作为慢病毒载体，以psPAX2和pCMV-VSV-G作为辅助包装载体，共同转染293T细胞，获得慢病毒颗粒；

（3）当步骤（1）的崂山奶山羊乳腺上皮细胞生长到占平皿面积50%时，采用步骤（2）获得的慢病毒颗粒进行感染；感染24h后，更换新鲜培养液；感染72h后，向培养液中加入Puromycin进行筛选，获得阳性细胞；

（4）将筛选的阳性细胞用不含Puromycin的培养液扩大培养，即构建得到崂山奶山羊乳腺上皮细胞系；

步骤（1）中，所述培养液为含有10%的胎牛血清、5μg/mL胰岛素和1μg/mL氢化可的松的DMEM/F-12；

步骤（2）中，将7.5μg pCDH-CMV--MCS-SV40LT-copGFP-P2A-Puro、6μg psPAX2和6μgpCMV-VSV-G共同转染进入293T细胞，48h后收获上清；72h后收获上清和细胞，并与之前收获的上清混合，反复冻融使细胞破裂，过滤，收集上清液，将上清液与5×PEG8000混合，4℃沉降过夜，4000g离心1h，去除上清，将沉淀用DMDM培养液溶解，即获得慢病毒颗粒；

步骤（3）中，在进行慢病毒转染时，同时加入5μg/ml的polybrene；

步骤（4）中，将筛选的阳性细胞用不含Puromycin的培养液扩大培养50代以上。

2.根据权利要求1所述的分泌型的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系，其特征在于，步骤（1）中，获得崂山奶山羊乳腺上皮细胞的步骤为：取处于泌乳期第35天的健康崂山奶山羊的乳腺组织，放入75%酒精浸泡消毒，用PBS冲洗干净后去除脂肪组织和结缔组织，再用PBS冲洗至溶液不再浑浊；然后将腺泡组织剪碎并冲洗干净，放入离心管中，加入相对于剪碎后的腺泡组织三倍体积的0.2%胶原酶Ⅰ，37℃震荡消化至组织块模糊，加入PBS稀释，充分吹打分散细胞后过200目细胞筛，收集滤液，1500rpm离心10min，弃上清，加入适量培养液重悬细胞。

3.权利要求1或2所述的崂山奶山羊乳腺上皮细胞系在构建炎症反应动物模型中的应用。