[发明专利]一种含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法

说明书

本发明公开了一种含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法，其特征在于，采用反向高效液相色谱梯度洗脱法，其流动相系统为：A、超纯水，B、乙腈；在T‑α‑MCA峰至GUDCA峰之间，流动相中B相体积比例逐渐增加，增加速率小于等于每分钟0.86％。本发明采用反向高效液相色谱梯度洗脱法分离胆汁酸代谢组分分离方法，是通过制定梯度洗脱方案，实现了在短时间内分离胆汁酸代谢组分，使得其中的含有的8对同分异构体，皆能有效分离，分离度达到定量测试标准的要求，甚至包括现有技术不能分离的同分异构体。

技术领域

本发明属于代谢组学领域，更具体地，涉及一种分离同分异构体胆汁酸的方法。

背景技术

胆汁酸(Bile acids,BAs)是生物体内一类非常重要的代谢物，构成胆汁的主要有机成分，是几种结构类似的类固醇酸的统称。主要功能是作为乳化剂促进食物中脂肪的代谢和脂溶性维生素和胆固醇的吸收，还可以作为信号分子参与多个信号传导途径，同时也是菌群与宿主互利共生的协调者。胆汁酸按来源可分为初级胆汁酸和次级胆汁酸，前者是肝细胞以胆固醇为原料直接合成，而后者是由初级胆汁酸随胆汁进入肠道后，经历了肠道细菌的分解，以及肠肝循环后形成的产物，故冠名为“次级”。胆汁酸按化学结构可分为游离胆汁酸和结合胆汁酸，游离胆汁酸主要是指胆酸 (cholic acid,CA)、脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)、鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)、石胆酸(lithocholic acid,LCA)，结合胆汁酸是前者通过酰胺键与甘氨酸、牛磺酸、硫酸、葡糖醛酸结合的产物，多与甘氨酸、牛磺酸结合。临床诊断上胆汁酸浓度是肝胆疾病、胃肠疾病如胆汁淤积的一项重要依据，科学研究上胆汁酸与肥胖、肠胃肿瘤、肠道菌群、能量代谢等密切相关，因此亟需一种针对胆汁酸的全面快速、专一灵敏的精准定量测定方法，这对健康领域和代谢组学领域的基础研究具有显著意义。

目前市面上已有多种胆汁酸测定方法，主要是基于液相色谱-质谱的方法。其中文献(Penno,C.A.,D.Arsenijevic,T.Da Cunha,G.A. Kullak-Ublick,J.-P.Montani andA.Odermatt.Quantification of multiple bile acids in uninephrectomized ratsusing ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Anal methods.2013,5(5):1155-1164)中的测定方法被广泛使用，使用高效液相色谱(UPLC)对胆汁酸进行分离，使用三重四级杆质谱(QqQ)、电喷雾电离(ESI)和多反应监测(MRM)采集碎片信息，通过比对标准品的保留时间和离子对信息来定性，具有高选择性、定性准确的优点，但是存在检出种类少、同分异构体分离度差等缺点，胆汁酸同分异构体由于分子量相同，离子碎片通常也完全相同，无法通过质谱的MRM技术进行区分，因此色谱上不能分离的同分异构体无法进行准确的定性定量分析，而这些同分异构体胆汁酸往往具有重要的生理功能，极大的阻碍了相关基础研究，因此亟需一种有效分离同分异构体胆汁酸的色谱方法来解决以上问题。

现有技术1(Alterations of Bile Acids and Gut Microbiota in ObesityInduced by High Fat Diet in Rat Model)发展了一种胆汁酸检测方法，基于高效液相色谱质谱联用，并应用于大鼠肝脏、粪样、血浆和肠道内容物中28种胆汁酸的定量检测，但是对于T-α-MCA/T-β-MCA这类同分异构体分离度差。

现有技术2(中国专利文献CN108072704A)公开了基于液相色谱质谱联用的粪便中胆汁酸的检测方法，该方法将色谱分离及质谱分辨技术结合，同时检测26种胆汁酸，但是对于β-MCA/ω-MCA、T-α-MCA/T-β-MCA这两类同分异构体分离度差。