[发明专利]一种脐血间充质干细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了一种脐血间充质干细胞的分离培养方法，属于生物技术领域。该分离培养方法包括以下步骤：对脐血进行离心处理，取上层得到血浆，下层为细胞；对血浆进行灭活处理后，再进行离心处理，取上清得到自体血清；将下层细胞与生理盐水混合后，再置于淋巴细胞分离液中进行离心处理，得到脐血单个核细胞；用无血清培养基重悬脐血单个核细胞，并置于自体血清包被的培养皿中进行原代培养，得到原代的间充质干细胞往原代间充质干细胞中添加细胞消化液进行细胞消化处理后，再进行传代培养。上述方法在分离及培养过程中不添加双抗，故不会对细胞产生毒性。另外，上述方法是采用离心分离的自体血清包被培养皿，故其不会引入动物源性的病毒。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种脐血间充质干细胞的分离培养方法。

背景技术

人脐血间充质干细胞(Human umbilical cord blood-derived MSCs，hUCB-MSCs)是存在于人脐带血中的一种成体干细胞，其具有旺盛的自我更新能力以及向多胚层分化的潜能，在适宜的条件下，hUCB-MSCs能定向分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等，并且能够分泌多种细胞活性因子，具有免疫调节、抑制炎症、减少凋亡等机能。另外，hUCB-MSCs还具有免疫原性低、来源广泛、伦理争议少等优点。与骨髓来源及脂肪来源的间充质干细胞相比较，人脐血来源的间充质干细胞增殖能力强，更容易诱导分化为软骨细胞、有更强的抗炎效果。与人脐带来源的间充质干细胞相比较，人脐血间充质干细胞较小，且生长速度较快，因此，治疗膝关节炎，人脐血来源的间充质干细胞更具有优势，可以作为治疗膝骨关节炎等疾病的理想干细胞来源。

然而，由于人脐血中所含的间充质干细胞含量较少，其分离及培养的要求较高，目前在国内对分离人脐血间充质干细胞的报道较少；另外，现有传统的体外脐血间充质干细胞的培养方法，都会在培养基里加入一定浓度的胎牛血清，主要是为了给间充质干细胞的生长增殖提供养分如激素、生长因子、转运蛋白等，但这种方法存在多种缺点：如血清批次间的差异波动，成分不明确，来源不稳定等各种原因，使用前需要进行大量的验证工作，因此会促使生产和科研工作变得复杂。因此，研究一种无需血清的人脐血间充质干细胞的分离培养方法对于治疗膝关节炎等骨科疾病有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐血间充质干细胞的分离培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种脐血间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

对脐血进行离心处理，取上层得到血浆，下层为细胞；

对所述血浆进行灭活处理后，再进行离心处理，取上层得到自体血清，备用；

将所述下层细胞与生理盐水混合后，再置于淋巴细胞分离液中进行至少一次的离心处理，弃上清，得到脐血单个核细胞；

用所述自体血清包被培养皿，得到自体血清包被的培养皿，备用；

用无血清培养基重悬所述脐血单个核细胞，并置于所述自体血清包被的培养皿中进行原代培养，得到原代间充质干细胞；

往所述原代间充质干细胞中添加细胞消化液进行细胞消化处理后，再进行传代培养。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述步骤中，灭活处理的温度为50～60℃。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，生理盐水中氯化钠的质量百分比浓度为0.9％。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，无血清培养基为添加有L-谷氨酰胺的Lonza无血清培养基。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，细胞消化液为胰酶细胞消化液。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，所述胰酶细胞消化液中胰酶的质量百分比浓度为0.125％。