[发明专利]一种微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的方法及其在胰腺癌早期诊断中的应用

说明书

本发明提供一种微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的试剂盒包括微流控芯片，所述微流控芯片包括基底层和位于基层上的顶层，上下两层相连通；基底层和顶层均设有微流通道和孔，微流通道与孔相连通，底层和顶层通过混合流道相通；基底层和顶层分别设有加样孔、反应孔、检测孔、质控孔、废液排出孔；基底层的反应孔包被半乳糖凝聚物‑1的单克隆抗体或抗GPC1的IgG抗体；所述基底层的加样孔和反应孔喷涂聚乙二醇PEG6000聚合物；基底层的反应孔固化有捕获纳米磁珠，所述磁珠与量子点标记外泌体抗GPC1特异性抗体的偶联。通过与其配套设备的量子点荧光免疫分析系统检测技术相结合，本发明方法灵敏度高、所需样本量小，检测所用设备成本低、可高通量、特异性高、准确度高。

技术领域

本发明属于医学生物检测技术和体外诊断试剂的领域，具体涉及一种微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的方法及其在胰腺癌早期诊断中的应用。

背景技术

胰腺癌被称为“癌症之王”，其死亡率高达90％左右，是全球最常见的恶性肿瘤之一。胰腺癌因为没有特异症状，起病隐匿、进展迅速，早期诊断十分困难，容易漏诊和误诊，确诊时通常肿瘤已转移到其他脏器，导致手术成功率和术后5年存活率都很低，仅为3％。无论国内、国外对胰腺癌的研究都明显滞后于其它胃肠道癌症。根据中国国家癌症中心公布的数据，在近10年来，中国胰腺癌发病率和死亡率却在不断升高；《2018年中国癌症统计数据》结果显示，我国2018年胰腺癌的新发病例数为6.74/10万，其中，男性患者7.45/10万人，胰癌死亡患者3.47/10万人，其中包括男性6.64/10万人，女性5.18/10万人。胰腺癌缺乏特异性肿瘤标志物，虽然大部分胰腺癌患者血清CA19-9水平显著升高，但是，也只能用于监测病情和反映预后，由于其特异性欠佳，尤其是与胆系疾病的鉴别诊断困难，且在胰腺癌早期有时正常，因而单独应用CA19-9不能对胰腺癌进行早期诊断。如果仅依靠传统的影像学手段难以实现胰腺癌的早期诊断及大规模的人群筛查。因此，胰腺癌的研究目前是国内外学者关注的焦点和研究的热点，大家迫切寻找敏感、特异的、无创的胰腺癌早期诊断方法，迫切需要一种能够早期诊断胰腺癌及预后监测的检测技术。

外泌体参与调控肿瘤等多种疾病，已经成为新的研究热点。外泌体(exosome)存在于人各种体液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁等，包含细胞特异的蛋白、脂质和核酸可以作为疾病诊断的标记。外泌体作为人体内重要的囊泡，直径约为30-200nm，密度在1.13-1.21g/ml，具有杯状形态、双层膜结构，其生物学功能受到越来越多的关注。有研究发现肿瘤来源的外泌体可通过将其遗传信息转移至受体细胞来促进肿瘤生长、侵袭和转移，并抑制免疫反应。鉴于其在肿瘤进展中的功能，外泌体被认为可应用于临床早期检测人类恶性肿瘤的最有前景的生物标志物。肿瘤来源的外泌体是一个异质性的群体，并产生独特的肿瘤微环境。肿瘤是由不同的基因和表型的肿瘤细胞形成的复合物，比如干细胞、基质细胞、成纤维细胞和免疫细胞等等，所有这些细胞分泌的外泌体组成了肿瘤细胞的特殊的微环境，并且形成了细胞与细胞之间的交流，促进肿瘤血管新生和肿瘤转移，以及直接作用于肿瘤细胞等途径，影响肿瘤的进展。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(Glypican-1，简称GPC1)是胰腺肿瘤外泌体的特定标志物，研究发现GPC1在胰腺癌细胞外泌体中大量表达，且外泌体GPC1的含量与肿瘤大小成正比。外泌体GPC1蛋白检测可用于临床癌症诊断和治疗监测，具有重要意义。2015来自美国M.D安德森癌症中心研究者们通过大量的胰腺癌患者血清样本分析发现，相比正常人，胰腺癌患者血清中GPC1阳性的外泌体占比显著增高。进一步研究发现，GPC1阳性外泌体在早期胰腺癌患者的血清中丰度显著高于正常人群，能够以100％的准确性和敏感性诊断早期和晚期胰腺癌，这一发现提示其可作为早期诊断胰腺癌的新检测方法。