[发明专利]核酸的靶向整合

权利要求书

1.一种能够表达目的多肽的宿主细胞，所述宿主细胞包含：

a)侧接有两个重组识别序列(RRS)的编码第一目的多肽的靶向整合的外源核酸目的序列(SOI)和第一选择标志物，其中靶向整合的外源SOI整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座内；以及

b)编码第二目的多肽的随机整合的外源核酸SOI和第二选择标志物，其中随机整合的SOI至少一次整合在所述宿主细胞的基因组中。

2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述第一目的多肽和所述第二目的多肽相同。

3.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述第一选择标志物和所述第二选择标志物相同。

4.根据权利要求1所述的宿主细胞，其包含一至十个随机整合的外源核酸SOI。

5.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述靶向基因座与选自SEQ ID No.1至SEQ IDNo.7的序列至少约90％同源。

6.根据权利要求1所述的宿主细胞，其进一步包含整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座内的编码第二目的多肽的第二靶向整合的外源核酸SOI和第二选择标志物，其中所述第一靶向整合的外源核酸SOI和所述第一选择标志物侧接有第一RRS和第三RRS，并且第二靶向外源SOI和所述第二选择标志物侧接有第二RRS和所述第三RRS。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的宿主细胞，其中所述目的多肽选自由以下项组成的组：单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)和Fc融合蛋白质。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为CHO宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHO K1M宿主细胞。

11.根据权利要求1-7中任一项所述的宿主细胞，其中所述SOI与选择标志物的所述靶向整合由外源核酸酶促进。

12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述外源核酸酶选自由以下项组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、TAL效应物结构域融合蛋白质、RNA引导的DNA核酸内切酶、经工程化改造的大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)核酸内切酶。

13.一种表达目的多肽的方法，所述方法包括：

a)提供宿主细胞，所述宿主细胞包含整合在所述宿主细胞的基因组的靶向基因座处的外源核苷酸序列，其中所述外源核苷酸序列包含侧接第一选择标志物的两个RRS；

b)向(a)中提供的所述细胞中引入核酸，所述核酸包含两个RRS，所述两个RRS与整合的外源核苷酸序列的所述两个RRS相匹配并且侧接编码第一目的多肽的第一外源SOI和第二选择标志物；

c)引入重组酶或编码重组酶的核酸，其中所述重组酶识别所述RRS；

d)选择表达所述第二选择标志物的细胞；

e)通过随机整合，将编码第二目的多肽的第二外源SOI和第三选择标志物引入所述宿主细胞的基因组中；

f)选择表达所述第三选择标志物的细胞；以及

g)在足以表达所述第一目的多肽和所述第二目的多肽的条件下培养所述宿主细胞。

14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括从宿主细胞培养物中回收所述第一目的多肽和所述第二目的多肽。