[发明专利]固相螯合剂材料，其制备方法及其用于纯化蛋白质的用途

说明书

本发明涉及一种固相螯合剂材料，可用于蛋白质纯化等方面。该固相螯合剂材料包括一个固相、结合至所述固相的多胺基团和结合至所述多胺基团的螯合基团。对于每个多胺基团，至少一部分的多胺基团与至少两个螯合基团连接。每个螯合基团包含一个或多个氨基聚羧酸基团(APA基团)，条件是每个与至少两个螯合基团连接的多胺基团的APA基团的数目为至少三个。几个APA可以形成线性螯合链或支化螯合链，其中APA基团通过双功能或三功能连接子相互连接。本发明的负载金属离子固相螯合剂材料展示强大的金属结合能力、对螯合剂、还原剂和碱性溶液的高稳定性、对蛋白质的高亲和力，以及极高的结合能力。此外，本发明涉及一种制备所述固相螯合剂材料的方法和一种以负载金属离子的固相螯合剂材料纯化组氨酸标记重组多肽和蛋白质、磷蛋白和金属配位蛋白质的方法。

技术领域

本发明涉及固相螯合剂材料的领域和这种固相螯合剂材料的制备方法。此外，本发明涉及一种用负载金属的固相螯合剂材料以纯化多肽和蛋白质的方法，以及负载金属的固相螯合剂材料包括用于固定化蛋白质的金属亲和纯化的用途。

技术背景

由Porath(《自然》258：598，1975)开发的固定化金属亲和色谱法(IMAC)已成为用作纯化重组蛋白的标准方法；当需要对大量重组蛋白进行纯化时，它仍是最受欢迎的方法之一。

该方法的原理是基于在蛋白质的氨基酸侧链上引入多个组氨酸基团，这使它们对固定的金属离子具有更高的亲和力。这些所谓的“组氨酸标记”由连续的组氨酸残基以及组氨酸与其他氨基酸结合而成，通常包括六至十个组氨酸。这些“组氨酸标记”显示出比天然蛋白质高得多的对固定化金属离子的亲和力，因此可以进行高度纯化，尤其是在将低浓度的咪唑添加到结合和洗涤缓冲液中时，可减少没有组氨酸标记的蛋白质的非特异性相互作用。

或者，IMAC可用于纯化磷蛋白，其中金属离子直接与磷酸基团结合。通过这种方法，可以将磷蛋白与不具有磷酸基团的蛋白分离；不具有磷酸基团的蛋白与金属离子之间没有结合或只有近似弱的结合。

IMAC树脂可与金属(例如Zn和Cu)结合使用，以可逆方式结合金属结合蛋白(例如锌指蛋白)和铜相互作用蛋白(例如铜氧还蛋白或血蓝蛋白)。

用于IMAC的配位体可以基于配位体可以在金属离子上占据的配位体位置数进行分类。因此，获得三个金属离子结合基团(例如胺、羧基、磷酸盐等)的螯合剂被称为三配位基螯合剂。四配位基螯合剂可以在金属离子上配位到四个位置，而五配位基螯合剂可以占据五个位置。

二十多年来，作为三配位基螯合剂的固相固定化亚氨基二乙酸(IDA)和作为四配位基螯合剂的氨基三乙酸(NTA)被确立为IMAC的标准材料。四配位基“Talon”配位体以及五配位基螯合剂，例如三羧甲基乙二胺(TED)，是也可以从市场上买得到的替代螯合剂。近年来，一些基于五配位基螯合剂的树脂，例如完整的His Tag树脂(罗氏诊断有限责任公司)和Ni Sepharose Excel(通用电气医疗)已进入市场。

对于IMAC，已经成功地应用了许多不同金属，因此已研究了例如Ni、Co、Cu、Fe、Ca、Zn、Al、Eu、Ga和Sc。为了纯化磷蛋白，广泛使用了AI与IDA结合使用，以及与Fe、Ga和Eu与NTA结合使用。

应当指出的是，特别是可以非常容易获得且成本低的亚氨基二乙酸具有以下缺点：仅通过三个功能化就能将金属离子固定在固相上；因此众所周知，金属离子被浸出到缓冲液中，蛋白质结合能力从而降低，且该洗脱缓冲液中可能含有痕量的金属离子。并且，在金属离子上该蛋白质具有几乎三个自由配位位点，一些没有组氨酸标记的蛋白质也与树脂结合，因此纯化后获得了污染的洗脱液。