[发明专利]用于基因递送以在细胞内持续存在的载体

权利要求书

1.一种用于将核酸构建体引入靶细胞中以进行持续表达的方法，所述方法包括向所述靶细胞给予共价封闭的非病毒DNA构建体，所述共价封闭的非病毒DNA构建体包含：

a.至少一个DD-ITR，所述DD-ITR包含：

i.反向末端重复，所述反向末端重复具有A、A’、B、B’、C、C’和D区域，

ii.D’区域，

iii.其中，所述D和D’区域是互补回文序列，并且其中，所述D和D’的位置与所述A和A’区域邻近；

b.核酸构建体的互补链，包含能够退火成可表达的dsDNA的预定的DNA序列；

c.其中，所述DNA构建体形成具有共价封闭的发夹末端的线性DNA；以及

d.其中，所述DNA构建体能够在所述靶细胞中表达所述预定的DNA序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域包含切口产生位点。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域的长度为至少5个核苷酸。

4.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域的长度为约20nt。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述D区域对应于细小病毒ITR的细小病毒D区域。

6.如权利要求1所述的方法，其中，所述细小病毒是依赖病毒。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述依赖病毒是AAV。

8.如权利要求1的方法，其中，所述预定的DNA序列与启动子可操作地连接。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述ITR充当启动子。

10.如权利要求8所述的方法，其中，所述启动子与所述ITR是分开的。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述DD-ITR驱动所述预定的DNA序列的表达。

12.如权利要求4所述的方法，其中，所述D和D’区域具有置换、插入和/或缺失，并保留所述区域的至少5个核酸。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所保留的核酸包含所述A和A’区域以及所述D和D’区域的切口产生位点和/或接合点。

14.如权利要求1所述的方法，其中，所述预定的DNA序列编码蛋白质、蛋白质片段、肽或功能性RNA。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述功能性RNA选自于由微小RNA、RNAi、shRNA和用于Crisper Cas 9重组的向导RNA所组成的组。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述预定的DNA序列之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。

17.如权利要求14所述的方法，其中，在所述D和D’区域与所述启动子之间存在至少2个核苷酸作为间隔区。

18.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少5个核苷酸。

19.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少20个核苷酸。

20.如权利要求16或17所述的方法，其中，所述间隔区为至少25个核苷酸。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述至少一个DD-ITR由AAVITR、细小病毒ITR或合成的ITR产生。