[发明专利]细胞制造方法

说明书

本发明的目的在于提供一种能够由多能干细胞高效地诱导制造胚体内胚层细胞以及胰岛素产生细胞的新方法。一种由多能干细胞制造胚体内胚层细胞的方法，包括：将多能干细胞在作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第一培养，然后在未作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第二培养的步骤。

技术领域

本发明涉及一种多能干细胞的分化诱导方法，能够由多能干细胞高效地诱导制造胚体内胚层细胞以及胰岛素产生细胞。

背景技术

由人工多能细胞、胚胎干细胞(ES细胞)等多能干细胞分化诱导为胰岛素分泌细胞(胰岛素产生细胞、胰岛β细胞)，并应用于糖尿病治疗的研究正在发展。已知在多能干细胞的分化诱导时，在不同的分化阶段会出现具有不同特征的细胞(WO 2009/012428、WO 2016/021734)。例如，该分化阶段按照分化程度由低到高，可以大致分类为多能干细胞、胚体内胚层细胞、原肠管细胞、后前肠细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞、胰岛素产生细胞、胰岛β细胞。

目前，研究并报道了对处于各个分化阶段的细胞进行诱导制造的方法。例如，非专利文献1记载了有关由多能干细胞向胚体内胚层细胞的诱导，在调查了培养基中血清替代物即B-27补充剂或B-27补充剂(INS(-))的添加、以及培养基中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂即LY294002的添加的影响后，发现在添加了B-27补充剂(INS(-))的情况下，能够最高效地诱导胚体内胚层细胞。

此外，非专利文献2记载了有关由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导，通过在使用含有20μM的LY294002的培养基培养1天后，使用含有10μM的LY294002的培养基培养2天，胚体内胚层细胞的标记发生高表达。

而且，非专利文献3中记载了由ES细胞制造胰腺前体细胞的方法，其中，记载了有关由ES细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导，使用添加了胰岛素-转铁蛋白-硒的培养基。

然而，通过以往的方法制造的胚体内胚层细胞，其细胞数量和纯度不够高，在该领域中仍然企望由多能干细胞高效地诱导制造胚体内胚层细胞以及胰岛素产生细胞的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO 2009/012428

专利文献2：WO 2016/021734

非专利文献

非专利文献1:Transplantation Proceedings,44,1127-1129(2012)

非专利文献2:Nat Commun.2015May 22；6：7212

非专利文献3:PLoS ONE May 2012,Volume 7,Issue 5,e37004

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于提供一种能够由多能干细胞高效地诱导制造胚体内胚层细胞以及胰岛素产生细胞的新方法。

用于解决课题的手段

本发明人等发现，在进行由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导时，若使胰岛素持续地发挥作用，则所获得的细胞中含有较多的胚体内胚层细胞以外的细胞。另一方面，在进行由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导时，未作用胰岛素的情况下，细胞数量未增加，无法获得充分数量的胚体内胚层细胞。

本发明人等为了解决这些问题而进行了深入研究，结果发现，在进行由多能干细胞向胚体内胚层细胞的分化诱导时，与使胰岛素持续地发挥作用或者未作用胰岛素的情况相比，通过在作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第一培养，然后在未作用胰岛素的条件下的分化诱导培养基中进行第二培养，能够制造高纯度的胚体内胚层细胞，且能够使细胞数量增加。还发现能够由所获得的胚体内胚层细胞制造高纯度的进一步分化的细胞。

本发明是基于这些新认知而完成的，包括以下技术方案。