[发明专利]糖基化肽的检测和定量

说明书

一种纯化和/或分离糖肽以及定量所述糖肽的方法。所述方法包括在允许糖肽结合至亲水性富集底物的条件下使包含所述糖肽的样品与所述亲水性富集底物接触。用甲酸铵和乙腈(ACN)的水溶液将所述糖肽从所述亲水性富集底物洗脱以产生富集的糖肽样品，可对所述富集的糖肽样品进行分析以鉴定特定糖肽。

技术领域

本发明涉及生物药物，并且涉及蛋白质如治疗性抗体及其片段的体内翻译后糖基化的检测和定量。

背景技术

治疗性单克隆抗体(mAb)是在哺乳动物细胞中产生的具有许多产物变体的异质分子，所述变体包括由翻译后修饰(PTM)产生的变体。N-连接的糖基化是治疗性抗体中的主要PTM。监管机构要求对N-连接的聚糖结构的表征和对个别糖型的定量以定义药物产品的质量、展现批次间的一致性并确保对制造过程的控制。传统上，通过从抗体中酶促释放聚糖、然后用荧光试剂标记来定量抗体内的N-连接的聚糖。或者，可通过分析由抗体的胰蛋白酶消化产生的糖肽来在肽水平下表征糖基化。然而，具有异质糖型的糖肽通常不能通过传统上用于肽作图的基于反相的液相色谱法(RPLC)良好地分离。此外，在线质谱法(MS)诱导的糖肽中糖链的源内断裂可产生截短的糖型伪影，所述糖型伪影使得使用MS对不同糖型的相对丰度的准确定量折衷。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种纯化和/或分离糖肽的方法，其中所述方法包括：(a)在允许糖肽结合至亲水性富集底物的条件下使包含所述糖肽的样品与所述亲水性富集底物接触；(b)洗涤所述亲水性富集底物以从所述亲水性富集底物中除去非糖肽污染物；以及(c)用甲酸铵和乙腈(ACN)的水溶液将所述糖肽从所述亲水性富集底物洗脱，从而产生富集的糖肽样品。任选地，所述方法包括将所述富集的糖肽样品施加至分离柱，并且将所述糖肽从所述分离柱洗脱。

在一些实施方案中，所述亲水性富集底物包括固相萃取(SPE)色谱底物。

在一些实施方案中，所述亲水性富集底物包含基于二氧化硅的氨基丙基吸附剂材料。

在一些实施方案中，所述甲酸铵和ACN的水溶液包含在水中的约100-400mM甲酸铵和约2.5％至约10％ACN。

在一些实施方案中，所述甲酸铵ACN溶液包含在水中的200mM甲酸铵和5％ACN。

在一些实施方案中，用甲酸和ACN洗涤溶液洗涤所述亲水性富集底物以除去非糖肽污染物，所述甲酸和ACN洗涤溶液包含按体积计0.5％至约5％的甲酸和按体积计约85％至约95％的ACN，其余为水。

在一些实施方案中，所述甲酸和ACN洗涤溶液包含按体积计1％的甲酸、9％的H₂O、90％的ACN。

在一些实施方案中，所述分离柱包括亲水性相互作用(HILIC)柱。

在一些实施方案中，将所述糖肽从所述分离柱洗脱还包括将所述糖肽分离成一个或多个级分。

在一些实施方案中，将所述糖肽分离成一个或多个级分包括向所述分离柱施加流动相梯度。

在一些实施方案中，所述流动相梯度是10mM pH 4.5的甲酸铵至含有10mM pH 4.5的甲酸铵的90％ACN。

在一些实施方案中，所述流动相梯度是在H₂O中的0.05％TFA或在ACN中的0.045％TFA。

在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定所述级分中的一个或多个中存在的糖肽。

在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定与所述级分中的一个或多个中存在的糖肽相关的聚糖。

在一些实施方案中，所述聚糖包括N-聚糖。

在一些实施方案中，所述糖肽获自单克隆抗体。