[发明专利]糖基化肽的检测和定量

权利要求书

1.一种分离糖肽的方法，所述方法包括：

在允许糖肽结合至亲水性富集底物的条件下使包含所述糖肽的样品与所述亲水性富集底物接触；

洗涤所述亲水性富集底物以从所述亲水性富集底物中除去非糖肽污染物；

用甲酸铵和乙腈(ACN)的水溶液将所述糖肽从所述亲水性富集底物洗脱，以产生富集的糖肽样品；

将所述富集的糖肽样品施加至分离柱；以及

将所述糖肽从所述分离柱洗脱，从而分离所述样品中的糖肽。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述亲水性富集底物包括固相萃取(SPE)色谱底物。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述亲水性富集底物包括基于二氧化硅的氨基丙基吸附剂材料。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述甲酸铵和ACN的水溶液包含在水中的约100-400mM甲酸铵和约2.5％至约10％ACN。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述甲酸铵ACN溶液包含在水中的约200mM甲酸铵和约5％ACN。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中用甲酸和ACN洗涤溶液洗涤所述亲水性富集底物以除去非糖肽污染物，所述甲酸和ACN洗涤溶液包含按体积计约0.5％至约5％的甲酸和按体积计约85％至约95％的ACN，其余为水。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述甲酸和ACN洗涤溶液包含按体积计约1％的甲酸、约9％的H₂O和约90％的ACN。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述分离柱包括亲水性相互作用(HILIC)柱。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将所述糖肽从所述分离柱洗脱还包括将所述糖肽分离成一个或多个级分。

10.如权利要求9至11中任一项所述的方法，其中将所述糖肽分离成一个或多个级分包括向所述分离柱施加流动相梯度。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述流动相梯度包括约10mM pH 4.5的甲酸铵至含有10mM pH 4.5的甲酸铵的约90％ACN。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述流动相梯度包括在H₂O中的约0.05％TFA或在ACN中的约0.045％TFA。

13.如权利要求9至12中任一项所述的方法，所述方法还包括鉴定所述级分中的一个或多个中存在的所述糖肽。

14.如权利要求9至13中任一项所述的方法，所述方法还包括鉴定与所述级分中的一个或多个中存在的所述糖肽相关的聚糖。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述聚糖包括N-聚糖。

16.如权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述糖肽获自单克隆抗体。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述单克隆抗体具有同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。

18.如权利要求16或17所述的方法，所述方法还包括用蛋白酶消化所述单克隆抗体。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述蛋白酶包括胰蛋白酶。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述洗脱的糖肽进行质谱分析。