[发明专利]用于纯化重组蛋白的完全流穿过程

说明书

本发明涉及一种纯化蛋白质的方法，所述方法以连续的方式包括：一个过滤步骤，其涉及使用至少一种螯合剂；交换步骤，其涉及使用至少一层渗滤膜；以及精细纯化步骤，其涉及使用膜吸附器组合，其中所述组合的两个膜吸附器在作用机制方面是正交的。

技术领域

本发明涉及一种用于蛋白质，特别是单克隆抗体的小规模和大规模纯化的完全流穿纯化过程。

背景技术

抗体纯化可能是生物生产中成本最高的方面之一。单克隆抗体(mAb)一般使用三步式的三种树脂色谱法过程进行纯化，每一步至少使用一种特定的缓冲液系统。这种常规纯化过程包括捕获步骤，随后是中度纯化步骤，并以精细纯化步骤结束，并且通常需要3到5个工作日(包括储存和开放阶段)。在此类常规过程中，这三个步骤是在一系列不同的单元操作中执行的，由于需要在每个步骤之间调节pH、摩尔浓度和蛋白质浓度，因此这一系列不同的单元操作不能以连续的方式进行操作。因此，常规纯化过程一般在每个不连续步骤和数个系统之间需要许多不同的缓冲液和许多储存单元。因此，这些常规纯化过程容易受到污染、技术故障和人为错误的影响。另外，由于需要在每一步之间中断以浓缩洗脱液、调节pH和电导率并在下一步骤之前储存洗脱液，并且由于一个步骤无法在上一步骤完成之前开始，所以此类常规纯化过程特别冗长且成本高昂。

常规过程的高成本还归因于一般使用蛋白A基质作为纯化的第一步。实际上，从历史上看，一般在过程的早期放入最具选择性的树脂(这就是蛋白A的情况)，以去除尽可能多的杂质。然而，即使蛋白A是用于纯化单克隆抗体的最具选择性的介质，所述过程中仍然会残留污染物。这一步骤也是整个过程中成本最高的，这也是因为它被用作与大量污染物接触的第一步。另外，很难去除残留的污染物以符合药物规格。

随着细胞培养物效价的提高和用于生产的细胞培养物体积的增加，下游加工被视为行业瓶颈。这与单克隆抗体的生产尤其相关，在单克隆抗体的生产中，焦点已从批体积转移到下游加工能力。此外，早期临床前和临床阶段研究需要可以更快生产出的大量抗体。因此，行业中需要一种成本更低的过程，所述过程可以以连续的方式执行以用于蛋白质纯化，特别是用于抗体纯化，以及用于缩短获得批料所花费的时间，降低污染、技术故障和人为错误的风险，并降低过程扩大需求。

发明内容

诸位发明人已经发现了一种纯化蛋白质、特别是抗体的新型方法，所述方法仅包括以连续完全流穿方式的三个步骤，这些步骤均不涉及蛋白A，并且有利地仅使用一种缓冲液，同时仍允许获得高产率的具有优良纯度的纯化抗体。因此，所述纯化的蛋白质适用于医学应用。因此，所述方法可以用于纯化蛋白质以用于临床试验和/或用于制造包含所述蛋白质的药物组合物。另外，所述方法不需要在步骤间进行任何调节，并且因此从收获待纯化的蛋白质到最终产物可以在密闭系统中进行。

简言之，这种方法仅包括三个连续的步骤，旨在去除大量污染物的更低成本的技术用作第一步，用于第二步和第三步的技术越来越具有选择性以去除残留的少量污染物，并且因此其使用量与常规过程中的使用量相比更小。

因此，本发明的方法以连续的方式包括：一个过滤步骤，其涉及使用至少一种螯合剂；交换步骤，其涉及使用至少一层渗滤膜；以及精细纯化步骤，其涉及使用膜吸附器组合，其中所述膜吸附器组合的两个膜吸附器在作用机制方面是正交的。图1示出了本发明的方法。这三个纯化步骤有利地以这种特定顺序实施。另外，已经发现在整个过程中仅需使用一种缓冲液，即用于所述交换步骤的缓冲液。换句话说，在所述精细纯化步骤中任选使用的平衡缓冲液与用于所述交换步骤的缓冲液有利地相同。这种缓冲液有利地包含Bis Tris、Tris、Tris-HCl、磷酸盐和/或柠檬酸，例如与NaCl、乙酸和水组合。更特别地，可以在整个过程中仅使用一种缓冲液，从而确保所有步骤之间的相容性，并且使得能够节约供应链制造和质量控制并降低储存要求。