[发明专利]直接免疫组织化学和免疫细胞化学方法

说明书

本公开提供了用于直接免疫组织化学(IHC)染色和直接免疫细胞化学(ICC)技术的方法、试剂盒、和组合物，包括应用于多重试验、化学染色的样品、和细胞学样品。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年2月9日提交的美国临时申请号62/628,723的优先权权益，通过引用将其全部内容在此并入本文。

技术领域

本公开提供用于直接免疫组织化学(IHC)染色和直接免疫细胞化学(ICC)技术的方法、试剂盒、和组合物，包括应用于多重试验、化学染色的样品、和细胞学样品。

背景技术

异源组织样品的免疫组织化学(IHC)染色是评估目标抗原(如蛋白质)的目标表位的存在或其不存在的可靠方法。通常，IHC技术利用抗体来原位探测并可视化细胞抗原，例如，目标表位。然而，由于组织和细胞样品中目标表位经常弥散分布，信号放大对可视化此类细胞抗原是必要的。用于信号放大的已知技术包括使用与对细胞抗原和生物素-亲和素系统具有特异性的一级抗体结合的二级抗体。然而，即使用信号放大技术，基于样品中目标表位的浓度，IHC技术的应用也可受到限制。例如，包含检测限以下的目标表位的样品(例如，由于目标表位的弥散性质或通过化学染色对目标表位的掩蔽)可能不适合(amenable)通过IHC技术评估。

在术中程序期间使用IHC对提高患者治疗和结果可能是有价值的信息来源。术中指南——如由美国病理学家协会(College of American Pathologists)提供的那些指南——典型地建议在大约20分钟内向外科医师报告病理学数据。然而，很多IHC技术可能需要60至120分钟以获得结果。例如，当评估多于一种目标抗原和/或还对样品应用化学染色时，执行IHC技术所需的时间可能增加。

本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)通过引用以其整体并入。

发明内容

在一方面，本发明提供用于检测样品中多个目标表位的方法，方法包括：(a)第一抗体结合步骤，包括在适于形成包含第一目标表位和第一聚合的酶/抗体缀合物的第一复合物的条件下，使样品与包含多个第一酶分子和识别第一目标表位的第一抗体的第一聚合的酶/抗体缀合物接触；(b)第二抗体结合步骤，包括在适于形成包含第二目标表位和第二聚合的酶/抗体缀合物的第二复合物的条件下，使样品与包含多个第二酶分子和识别第二目标表位的第二抗体的第二聚合的酶/抗体缀合物接触；(c)第一抗体去除步骤，包括从样品基本上去除不形成第一复合物的第一聚合的酶/抗体缀合物；(d)第二抗体去除步骤，包括从样品基本上去除不形成第二复合物的第二聚合的酶/抗体缀合物；(e)第一酶底物接触步骤，包括使样品与第一酶分子的第一酶底物组合物接触；以及(f)第二酶底物接触步骤，包括使样品与第二酶分子的第二酶底物组合物接触，从而允许检测样品中的多个目标表位。

在一些实施方式中，第一酶分子和第二酶分子是不同的。在一些实施方式中，第一抗体结合步骤和第二抗体结合步骤同时执行。在一些实施方式中，第一抗体去除步骤和第二抗体去除步骤同时执行。在一些实施方式中，第一酶底物接触步骤和第二酶底物接触步骤同时执行。在一些实施方式中，第一酶底物接触步骤在第二酶底物接触步骤之前执行。在一些实施方式中，第一酶底物接触步骤在第二酶底物接触步骤之后执行。

在一些实施方式中，第一抗体结合步骤在第二抗体结合步骤之前执行。在一些实施方式中，第一抗体去除步骤和第一酶底物接触步骤在第二抗体结合步骤之前执行。在一些实施方式中，方法进一步包括第一抗体剥离步骤，第一抗体剥离步骤包括从第一目标表位解离(diassociating)第一抗体，其中第一抗体剥离步骤在第二抗体结合步骤之前执行。在一些实施方式中，方法进一步包括第一酶灭活步骤，第一酶灭活步骤包括灭活第一酶分子，其中第一酶灭活步骤在第二抗体结合步骤之前执行。