[发明专利]用于在悬浮培养物中分化人多能干细胞系的方法

说明书

本文描述了将多能干细胞分化为造血前体细胞、造血祖细胞、成红细胞和去核成红细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，并且在中胚层诱导阶段期间加入GSK‑3‑抑制剂或Wnt通路激活剂。在优选的实施方案中，多能干细胞在搅动的微载体培养物中扩增，且GSK‑3抑制剂是CHIR99021。本文还公开了用于本文公开的方法的细胞培养基，以及用于进行所述方法的试剂盒。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年1月18日提交的SG临时申请No.10201800488W 的优先权的权益，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。

技术领域

本发明一般涉及分子生物学领域。特别地，本发明涉及细胞分化的方法。

背景技术

已经提出人诱导多能干细胞(hiPSC)的红系分化作为产生无限供应的红血球(RBC)的手段。因此，需要开发可扩展的悬浮培养物分化方法。先前显示使用基于骨形态发生蛋白-4(BMP4)的分化方案在搅动微载体(MC) 悬浮培养物中扩增的人多能干细胞(hPSC)的红系分化，其中中胚层诱导和成红细胞扩增在静态条件下进行。然而，反复尝试实施此过程以区分多个hPSC 系显示红系分化中的可变性。

通用的O-阴性(neg)红血球(RBC)可来源于从具有O-阴性血型的供体产生的人诱导多能干细胞(hiPSC)的分化。人诱导多能干细胞产生的红血球有可能成为细胞的无限来源，以补充医疗保健行业的紧急输液需要。假定每单位血液需要一万亿红血球，则需要开发可允许产生增加数量的红血球的有效分化和生物过程。虽然已经描述了将人诱导多能干细胞分化为红系细胞的许多方法，但这些方法尚未证明能够扩大规模。

发明内容

在一个方面，本发明涉及将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，并且其中在中胚层诱导阶段期间加入GSK-3 抑制剂或Wnt通路激活剂。

在另一方面，本发明涉及用于将多能干细胞分化为造血前体细胞从而使用微载体胚状体(EB)从多能干细胞产生造血前体细胞的细胞培养基，所述细胞培养基包含骨形态发生蛋白、GSK-3激酶抑制剂，其中所述抑制剂选自由以下组成的组：CHIR99021、(2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟(Bio；CAS 667463-62-9)、Kenpaullone(CAS 142273-20-9)、GSK-3β抑制剂XII(TWS119； CAS 601514-19-6)、Bio-丙酮肟(CAS 667463-85-6)、CHIR-98014、SB216763 (CAS 280744-09-4)、GSK-3β抑制剂VIII(CAS 487021-52-3)及其组合，或Wnt通路激活剂、激活素A和血管内皮生长因子。

在另一方面，本发明涉及用于将多能干细胞分化为造血前体细胞从而使用微载体胚状体(EB)或多能干细胞从多能干细胞产生造血前体细胞的细胞培养基，所述细胞培养基包含骨形态发生蛋白、激活素A和血管内皮生长因子。

在另一方面，本发明涉及用于将多能干细胞分化为造血前体细胞从而使用微载体胚状体(EB)或多能干细胞从多能干细胞产生造血前体细胞的细胞培养基，所述细胞培养基包含骨形态发生蛋白、激活素A、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或其变体、激素、细胞因子和血管内皮生长因子。

在另一方面，本发明涉及用于将多能干细胞分化为造血前体细胞的方法，其中所述方法在悬浮搅动下进行，所述方法包括：a.(任选地)提供多能干细胞；b.将步骤a.的细胞暴露于如本文定义的细胞培养基中持续24小时(第0 天至第1天)，从而产生T-Brachyury(T-Bra；原条/早期中胚层标志物)阳性细胞；c.将步骤b.的细胞暴露于如本文所公开的细胞培养基中持续24小时(第 1天至第2天)；d.将步骤c.的附着于微载体的细胞暴露于如本文公开的细胞培养基中持续48小时(第2天至第4天)，由此步骤b.至d.诱导中胚层诱导； e.去除细胞培养基，并分离步骤d.的所得KDR+PDGFRα-造血前体细胞。