[发明专利]一种枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌L‑天冬氨酸α‑脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的改造方法通过组合突变设计出最佳突变体，对BsPanD的蛋白质进行改造，克服了之前野生型的酶因为严重的机制性失活而导致的催化稳定性低的局限，最终得到最佳突变体Q5(BsPanD^{I46V/I88M/K104S/I126*})，其催化半衰期和β‑丙氨酸产量分别为野生型的3.47和2.58倍，以L‑天冬氨酸为底物，转化后15L规模发酵罐产量为123.8g/L，转化率>99％，单位菌体生产β‑丙氨酸的能力为6.2g/g，将该突变体Q5进一步与L‑天冬氨酸酶(AspA)偶联，以富马酸为底物，β‑丙氨酸产量达到118.6g/L，因此大大降低了之前的高菌体量以及昂贵的底物成本，为β‑丙氨酸的工业化生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

β-丙氨酸，又名3-氨基丙酸，是唯一一种天然存在的β型氨基酸。虽然β-丙氨酸是一种非蛋白氨基酸，但却是一种潜在的功能性氨基酸。它是合成肌肽、泛酸及辅酶A的重要前体物质，被广泛应用于医药、食品和化工等领域，是非常有潜力的一种三碳化合物。

目前，β-丙氨酸的主要生产方法为化学合成法，主要为丙烯腈和丙烯酸法，但是这种方法需要高温高压的环境，能耗较大但是产品的得率低，并且会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。通过生物法制备β-丙氨酸具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，促进我国低碳和循环经济的发展，因此迫切需要一种有效的生物法高效制备β-丙氨酸。

微生物法生产β-丙氨酸涉及到一个关键的酶L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD，Laspartate-α-decarboxylase，EC 4.1.1.11)，它具有高度的底物特异性，可以催化L-天冬氨酸，使其在α位脱羧，形成β-丙氨酸。其中，微生物法制备β-丙氨酸又分为发酵法和酶转化法。(1)利用发酵法生产精细化学品具有原料来源广泛(如葡萄糖、甘油等)且廉价的显著优点，其相对较低的底物成本为大规模工业化带来巨大的商业化效益。随着代谢过程和合成生物学的发展，利用发酵法生产β-丙氨酸将会迎来更多的机遇，但是实现大规模的工业化生产，仍面临着巨大的挑战。主要体现在以下几点：①通过发酵法生产精细化学品，细胞生长与酶的表达存在竞争，如何平衡两者关系成为关键问题；②发酵法发酵周期长，必然导致生产强度低；③一方面，β-丙氨酸需要大量积累，另一方面，高浓度的β-丙氨酸会抑制细胞的生长，酶的表达随之受到抑制；④细胞存在大量代谢竞争途径，即使敲除一些副产物基因，仍然存在副产物积累过多的问题，影响产品得率，并增加下一步分离纯化工艺的困难。(2)目前，由于酶转化法具备高产量、高转化率以及较短的转化周期等优点而更具备工业应用价值。但是，酶转化法大规模制备β-丙氨酸受到以下限制：(1)底物L-天冬氨酸成本高，对工业不经济；(2)高浓度的L-天冬氨酸会严重抑制PanD的催化效率；(3)伴随着催化反应的进行，PanD存在严重的机制性失活，导致催化稳定性差，这极大程度限制了β-丙氨酸产业化的发展，是目前研究的重点问题。因此，从工业角度来看，迫切需要解决PanD的机制性失活问题，使得通过酶转化法制备β-丙氨酸实现规模化应用。

近几十年来，蛋白质工程已经成为在分子水平改善酶的性质的有效策略，如扩大底物范围、提高酶的活性和改善酶的稳定性的最有效的方法。因此，通过蛋白质工程设计BsPanD，可能解决其催化稳定性差的问题。蛋白质工程改造主要可以分四类：传统的定向进化(即非理性设计)、半理性设计、理性设计(基于结构与计算机技术)和多种策略的组合应用。目前，关于利用蛋白质工程改造PanD已经取得了一定的研究进展，然而，催化稳定性的改善效果仍然有限，远不能满足实际的工业化需求。