[发明专利]一种钴离子诱导型蛋白表达系统及应用

说明书

本发明公开了一种钴离子诱导型蛋白表达系统及应用，属于生物工程技术领域。本发明通过将响应钴离子的阻遏蛋白RcnR及其操纵序列rcnO与来源于枯草芽孢杆菌的强启动子P_veg构建在一起，得到了钴离子诱导型高效基因表达系统。当利用该系统表达腈水合酶时，以500μM钴离子作为诱导剂，酶活最高达到106.2±4.6U/mL，接近使用IPTG诱导系统的水平(121.4±4.0U/mL)。在利用该钴离子诱导型系统表达腈水合酶过程中，钴离子同时作为腈水合酶的诱导剂和金属配体，不需要额外添加化学诱导剂，降低了生产成本，简化了生产工艺。

技术领域

本发明涉及一种钴离子诱导型蛋白表达系统及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

诱导型外源基因表达载体在蛋白质表达，尤其是工业酶制剂生产方面有广泛应用。目前诱导型表达载体较为广泛使用的有基于lac操纵子构建的由乳糖或者异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的表达系统、基于ara操纵子构建的由阿拉伯糖诱导的表达系统以及基于xyl操纵子构建的由木糖诱导的表达系统。不过，诱导型的表达系统种类依然很少，性能依然不能满足大规模工业生产的要求，并且外源添加的诱导剂会大幅度提高生产成本，因此，开发经济、高效、更多诱导剂种类选择的外源蛋白表达载体对酶工程领域依然十分重要。

腈水合酶是催化腈类物质生成酰胺类物质的金属酶，在工业生产上应用广泛，主要用于丙烯酰胺和烟酰胺的生产。腈水合酶可由其活性中心所含金属离子的不同分为钴型腈水合酶和铁型腈水合酶。目前第三代腈水合酶生产工业菌株是红球菌Rhodococcusrhodochrous J1，通常使用异戊腈作为诱导剂，主要生产钴型腈水合酶。随着近年来基因工程技术的日益发展，在大肠杆菌等模式表达宿主中构建腈水合酶异源表达系统无论在成产成本、产量还是在成产工艺的可操作性上都显现出了巨大的优势。

大肠杆菌生长速度快、易于培养、发酵工艺简单、蛋白表达量高，这些特点使得利用大肠杆菌生产腈水合酶可以显著提高其产量，并降低生产成本，具有巨大的工业应用前景。目前，使用IPTG作为诱导剂的腈水合酶高效表达系统已经在大肠杆菌中构建成功并实际应用。但是在发酵生产钴型腈水合酶过程中，需要加入IPTG作为诱导剂表达蛋白，同时加入一定浓度的钴离子以激活腈水合酶的活性。而IPTG作为人工合成的乳糖类似物，价格较高，造成腈水合酶的生产成本较高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种利用钴离子同时作为基因表达诱导剂和腈水合酶配体的高效的腈水合酶表达系统。鉴于启动子是基因工程表达载体的重要元件，对外源基因表达水平有较大的影响，本发明将大肠杆菌Co/Ni调控系统的rcn组分构建到强启动子上，从而构建人工的由钴离子诱导调控的外源蛋白表达载体。该方法构建的表达系统既避免了在腈水合酶诱导表达的过程中添加额外的诱导剂，降低生产成本，同时又实现了腈水合酶的高效表达。

本发明的第一个目的是提供一种受钴离子诱导的表达载体，是将钴离子响应的阻遏蛋白RcnR、受阻遏蛋白RcnR调控的启动子与载体连接而成；所述受阻遏蛋白RcnR调控的启动子包括将阻遏蛋白RcnR的操纵序列rcnO连接到启动子P_veg下游构建得到的启动子；所述阻遏蛋白RcnR的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述操纵序列rcnO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子P_veg的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述阻遏蛋白RcnR的基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET28a(+)。

本发明的第二个目的是提供一种钴离子诱导蛋白表达的基因工程菌，是以上述表达载体为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。