[发明专利]一种钴离子诱导型蛋白表达系统及应用

权利要求书

1.一种受钴离子诱导的表达载体，其特征在于，是将钴离子响应的阻遏蛋白RcnR、受阻遏蛋白RcnR调控的启动子与载体pET28a(+)连接，将载体上的启动子替换为P_veg；所述受阻遏蛋白RcnR调控的启动子是将阻遏蛋白RcnR的操纵序列rcnO连接到启动子P_veg下游构建得到的启动子；所述阻遏蛋白RcnR的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述操纵序列rcnO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子P_veg的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种钴离子诱导蛋白表达的基因工程菌，其特征在于，是以权利要求1所述的表达载体为表达载体。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。

4.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达腈水合酶。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，编码所述腈水合酶的基因由融合的α/β亚基基因、编码调控蛋白P的基因组成；所述融合的α/β亚基基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述编码调控蛋白P的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6.一种生产腈水合酶的方法，其特征在于，应用权利要求4或5所述基因工程菌进行发酵，在钴离子诱导下表达蛋白。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述基因工程菌在LB平板上划线，挑取单菌落在LB培养基中200-220rpm，35-39℃培养8-14 h；按1-5%接种量将培养物转入LB培养基中200-220rpm，35-39℃培养至OD₆₀₀=0.4-0.6；加入钴离子后，温度降低至20-25℃进行蛋白表达。

8.如权利要求6或7所述的方法，钴离子添加浓度为400-600 μM。

9.权利要求1或2所述表达载体在生产含腈水合酶的产品方面的应用。