[发明专利]CH3结构域改造诱导形成的异源二聚体及其制备方法和应用

说明书

本发明属于抗体工程领域，提供一种了异源二聚体及其制备方法与应用。本发明通过综合考虑界面氨基酸之间的各种相互作用，例如离子作用、疏水相互作用和空间作用等，将“凸‑凹”模型和静电作用相结合，筛选到优选的CH3突变序列，其更倾向于形成异源二聚体，而不形成同源二聚体，因而大大提高了异源二聚体分子的产量。与参考文献CN106883297A和US20150307628A1相比，本发明涉及的“凸‑凹”模型构造方法更加简单、点突变更少，而且在不引入二硫键的情况下能将异源二聚体的纯度最高提高到95％以上。

技术领域

本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种CH3结构域改造诱导形成的异源二聚体及其制备方法和应用。

背景技术

双特异性抗体有多种构建方式，其中IgG型双特异性抗体具有和普通抗体相似的结构、理化性质和Fc段功能。通常IgG型双特异性抗体由两条氨基酸序列不同的重链(即抗抗原A的重链HC_A和抗抗原B的重链HC_B)和两条氨基酸序列不同的轻链(即抗抗原A的轻链LC_A和抗抗原B的轻链LC_B)组成。当4条多肽链组合时，两条重链之间会形成同源二聚体和异源二聚体，轻重链之间也会形成错配，因此会产生8种不同的组合方式，其中只有一种为所需要的目标抗体分子。而从8种分子中分离纯化得到目标分子效率极低且非常困难。

构造IgG型双特异性抗体有多种方法，通过改造Fc使之形成异源二聚体是其中重要的一种方法。早在20世纪90年代，Carter等人用“凸-凹”(knob-into-hole)模型改造抗体Fc段，较成功的实现了双特异抗体的制备(Ridgway,Presta et al.1996；Carter 2001)。Carter等在Fc第一条重链的CH3结构域上通过将一个侧链小的氨基酸突变成了一个侧链大的氨基酸从而创造出了一个“凸”，并将第二条重链上的CH3上的某些氨基酸突变成了侧链小的氨基酸创造出了“凹”。“凸-凹”模型的原理是“凸-凹”的相互作用支持异源二聚体的形成，而“凸-凸”模型及“凹-凹”模型阻碍同源二聚体的形成。然而在他们的研究结果中，“凹-凹”模型对阻碍同源二聚体的形成的能力仍然不够。

US2010286374A1公开了一种利用静电作用促进异源二聚体形成的方法。具体来说，将两条重链的CH3结构域中带电荷氨基酸分别突变为相反电荷的氨基酸，使得其中一条重链的CH3结构域总体上带正电荷，而另一条重链的CH3结构域总体上带负电荷，相同电荷的静电排斥会抑制同源二聚体的形成。然而，静电作用并不能完全抑制同源二聚体的形成，引入过多的突变反而引起蛋白表达水平的下降，反映出多个氨基酸突变情况下，界面氨基酸之间作用关系的复杂性。

将“凸-凹”模型和静电作用相结合是促进异源二聚体形成的有效方法。CN106883297A公开了一种方法，具体来说，在Carter等人的“凸-凹”模型基础上进一步在“凹”的一端引入F405K突变，增强“凹-凹”界面氨基酸之间静电排斥，同时在“凸”的一端引入K409A突变，避免“凸-凹”界面氨基酸之间产生静电排斥，从而抑制“凹-凹”同源二聚体的形成并维持“凸-凹”异源二聚体的形成。尽管该专利公开的方法能提高异源二聚体的形成，但其中的一个方案仅能将异源二聚体的比例最高提高到93％。

US20150307628A1公开了另一种利用“凸-凹”模型和静电作用促进异源二聚体形成的方法。具体来说，其中一个方案在Fc第一条重链的CH3结构域上通过K409W点突变创造出了一个“凸”，并将第二条重链上的CH3上通过F405T、D399V点突变造出了“凹”；在第一条重链的CH3结构域上通过K360E点突变使之带上负电荷，并将第二条重链上的CH3上通过Q347R点突变使之带上正电荷。该方案在不引入二硫键的情况下能将异源二聚体的比例最高提高到91.4±1.2％。

尽管CN106883297A和US20150307628A1公开的两种方法从原理上优于单纯的“凸-凹”模型并且进一步提高了异源二聚体的比例，但要把异源二聚体的比例提高到95％以上仍需要新的研究。

发明内容