[发明专利]一种慢病毒表达载体的设计及应用

说明书

本发明属于分子生物学及细胞生物学领域，具体涉及一种慢病毒表达载体的设计及应用。本发明设计载体，采用CMV enhancer和CMV promoter作为插入基因的转录起始元件；采用EF1a‑core promoter作为筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白GFP的转录起始元件，嘌呤霉素抗性基因和GFP序列之间通过T2A连接串联表达；采用慢病毒载体作为该载体骨架，将上述两个元件插入骨架载体，合理设计优化而成。采用本发明设计的慢病毒载体，可以高效表达插入基因，表达效率优于目前同类型特征的载体。

技术领域

本发明属于分子生物学及细胞生物学领域，具体涉及一种慢病毒表达载体的设计及应用。

背景技术

慢病毒载体(Lentiviral vector)是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体介导的基因表达持续且稳定，原因是插入基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒有广泛的宿主，可感染分裂和不分裂的细胞，几乎可以感染所有类型的细胞，特别适合质粒载体转染效率低的细胞。

目前，有多种形式的慢病毒表达载体，都是以慢病毒载体骨架，加载不同的基因操控元件设计而成。进行基因过表达时，可通过不同的实验目的选择不同元件组成的慢病毒表达载体。美国System Biosciences公司开发的具有双启动子的pCDH系列慢病毒载体，载体大小不超过9000bp，允许插入较大片段的基因，具有抗生素抗性基因和荧光蛋白双重筛选基因，可通过抗生素筛选获得稳转细胞株和通过荧光蛋白检测转染效率，这些独特优势特性使其成为主流的慢病毒表达载体之一。然而，发明人在实验中发现，pCDH系列载体的插入基因的表达水平并不很高，不能满足一些实验要求。而市场上同类型慢病毒表达载体，又不具备pCDH载体的优势特性。因此，很有必要设计一种兼具载体小、双重筛选标记、高水平表达插入基因等三个特征的慢病毒表达载体。

发明内容

针对上述问题本发明提供了一种慢病毒表达载体的设计及应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种慢病毒表达载体，慢病毒表达载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

进一步，所述载体的图谱为图1，序列见SEQ ID NO.1。

进一步，所述序列，含有以下载体元件：

a.Ampicillin抗性基因：允许载体在E.coli中使用Ampicillin筛选的序列；

b.PUC Ori：允许载体在E.coli中高拷贝复制的序列；

c.RSV promoter：促进病毒RNA在包装细胞中的转录的序列；

d.5'LTR-DeltaU3：病毒基因组整合进入宿主基因组的整合位点序列；

e.3'LTR-DeltaU3：病毒基因组整合进入宿主基因组的整合位点序列；病毒RNA在包装细胞中的转录终止序列；

f.Ψ:病毒RNA包装为病毒的信号序列；

g.RRE：HIV-1的Rev蛋白响应元件序列，允许病毒RNA通过Rev蛋白途径出核；

h.CPPT：HIV-1富含嘌呤的片段序列，促进病毒感染宿主细胞过程中病毒RNA转入宿主细胞核；

i.CMV enhancer/promoter：促进目的基因的高效表达的增强子和启动子序列；

j.BamHI/SalI/XhoI/XbaI：酶切位点序列，便于外源基因插入；

k.EF-1a core promoter：促进筛选基因的表达的启动子序列；