[发明专利]将CRISPR-Cas9系统导入人干细胞的方法

说明书

本发明涉及一种将CRISPR‑Cas9基因编辑系统高效导入人干细胞的方法，包括以下步骤：(1)构建获得HBB‑sgRNA‑Cas9‑T2A‑GFP‑SZ重组质粒；(2)采用Neon系统将HBB‑sgRNA‑Cas9‑T2A‑GFP‑SZ重组质粒导入人干细胞中；所述电穿孔转染的条件为：当人干细胞为人间充质干细胞时：脉冲电压1300‑1700V，脉冲时程小于30ms，脉冲次数至少一次；当人干细胞为人造血干细胞时为：脉冲电压1450‑1550V、脉冲宽度40ms，脉冲数至少一次；(3)细胞培养。本发明利用电穿孔法将CRIPSR‑Cas9基因编辑系统转入干细胞，能有效提高电穿孔转染后干细胞的存活率。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术，特别涉及一种将CRISPR-Cas9基因编辑系统导入人干细胞的方法。

背景技术

干细胞是现代生物医药技术研究领域的重要原材料，也是目前基因治疗领域中重要的靶细胞。在以干细胞为靶细胞的基因治疗中，将基因编辑系统转入干细胞的同时还需维持其具有的分化特性以及细胞活性等，因此所面临的挑战远高于对其它细胞的转染。目前，利用高效的CRISPR-Cas9基因编辑系统对干细胞进行基因修饰是基因治疗的重要手段，将外源基因转入谱系特异的干细胞，并能够使其整合进染色体或作为附加基因随细胞分裂维持高水平和持久的表达是基因编辑成功的关键点。

基于目前各研究报道，电穿孔转染法是除病毒载体及脂质体外针对干细胞最高效的基因转移手段，其原理是在电场作用下，细胞膜上形成小孔或开口，质粒能在电击产生的电场力作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔的区域形成可转移的复合物，随后质粒脱离复合物扩散至细胞质，部分质粒转移至细胞核内与染色体整合。电穿孔转染法是一种简便的基因转移方法，具有其他方法无法比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强、转染率高、适用细胞种类广谱等等。

鉴于CRISPR-Cas基因编辑系统转入干细胞进行基因治疗的临床转化应用，电穿孔转染法对于干细胞的基因导入具有更好的安全性和更高的转染效率，是现有转染方法中的最佳选择，然而电场作用会对细胞造成直接损伤，因此如何提高电穿孔转染后干细胞的存活率是亟待解决的重要问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种采用电穿孔转染法将CRISPR-Cas9基因编辑系统导入人干细胞的方法，可提高电穿孔转染后干细胞的存活率。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种将CRISPR-Cas9基因编辑系统导入人干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)化学合成CRISPR-Cas9表达框并连接GFP表达基因，构建获得Cas9-T2A-GFP-SZ骨架质粒；针对HBB基因设计靶向的HBB-sgRNA，所述HBB-sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；然后将HBB-sgRNA与Cas-T2A-GFP-SZ骨架质粒连接，获得HBB-sgRNA-Cas9-T2A-GFP-SZ重组质粒；

(2)采用Neon系统，利用电穿孔转染法将HBB-sgRNA-Cas9-T2A-GFP-SZ重组质粒导入人干细胞中；所述电穿孔转染的条件为：当人干细胞为人间充质干细胞时，电穿孔转染条件为：脉冲电压1300-1700V，脉冲时程小于30ms，脉冲次数至少一次；当人干细胞为人造血干细胞时，电穿孔转染条件为：脉冲电压1450-1550V、脉冲宽度40ms，脉冲数至少一次；

(3)将电穿孔完成后的样品进行细胞培养。

本发明的有益效果在于：