[发明专利]一种IV型胶原蛋白的检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种IV型胶原蛋白的检测试剂盒，包括有试剂R1和试剂R2，其特征在于：所述的试剂R1与试剂R2的体积比为3:1；

所述的试剂R1包括以下组分：

pH6.0-6.5的醋酸盐缓冲液             50mmol/L

牛血清白蛋白                        0.9g/L

叠氮钠                              0.01%

所述的试剂R2包括以下组分：

pH6.0-6.5的醋酸盐缓冲液             50mmol/L

Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒            20ml/L

Triton X-100                        8ml/L

甘氨酰胺盐酸盐                      13g/L

聚乙二醇8000                        25g/L

叠氮钠                              0.01%

所述的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒为通过组合型偶联剂，将Ⅳ型胶原蛋白抗体交联于羧基胶乳微球上，形成Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒；

所述的组合型偶联剂包括有以下组分：

碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐三者质量比为1.2﹕1.2﹕1；

所述检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：

（1）Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒的制备，包括以下子步骤

（1.1）用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液悬浮10%w/v且粒径100-200nm羧基胶乳微球，室温搅拌30min混合均匀，10000rpm转速下离心15min，去除上清液后用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌30min混合均匀，使其质量体积浓度为2%；

（1.2）取上述悬浮微球，边室温搅拌，边加入组合偶联剂；该组合偶联剂的成分为碳二亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐；

其对应质量比例为微球溶液﹕碳二亚胺﹕O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸﹕O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐=10﹕1.2﹕1.2﹕1；

O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐在加入前分别用1%醋酸溶液37℃超声10min溶解完全；

加入顺序为先加入碳二亚胺室温搅拌20min，再同时加入含O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸的醋酸溶液与含O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐的醋酸溶液，室温搅拌30min；

（1.3）用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液溶解鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白单克隆抗体，使其浓度为5mg/ml；

（1.4）边搅拌边快速将上述溶解后的抗体按照体积比抗体﹕胶乳微球=1﹕5加入到经过处理的胶乳微球中，室温持续搅拌30min后，调pH至6.5，室温孵育3h；

（1.5）孵育完成后在10000rpm转速下离心10min，去除上清液，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次10000rpm转速下离心10min，重复6次，完成最后一次离心，去上清液后用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，使其质量体积浓度为1%；

（1.6）加入3%质量体积浓度的牛血清白蛋白室温持续搅拌30min，静置封闭24h；

（1.7）时间到后，将封闭好的胶乳微球在10000rpm转速下离心10min，去除上清液，用50mmol/L，pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液洗涤，再次在10000rpm转速下离心10min，重复2次，用50mmol/L、pH6.0-6.5醋酸盐缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，得到质量体积浓度为1%的Ⅳ型胶原蛋白抗体胶乳颗粒；

（2）按照试剂R1和试剂R2的组分比例配置双试剂。