[发明专利]一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法

权利要求书

1.一种降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、利用植物原生质体提取总蛋白，再将总蛋白超滤后，收集滤液，将滤液样品先经过还原再进行烷基化处理后，得到待测样品；

S2、利用液质联用仪对待测样品进行测定，并对测定后的数据进行分析；

其中，所述数据的分析过程包括以下步骤：

利用ProteinLynx ProteinPilot软件分析质谱原始数据，自动计算色谱峰宽和质谱峰宽；

利用Paragon Algorithm算法结合ProteinPilot与TAIR蛋白数据库检索蛋白；

利用SignalP5.0 在线软件分析所鉴定小肽是否含有信号肽剪切位点；

所述步骤S2利用液质联用仪进行检测过程中，用C18柱分离小肽，液相色谱部分使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为2%乙腈/0.1%甲酸/98% H₂O和流动相B为98%乙腈/0.1%甲酸/2% H₂O，所述检测过程包括通过梯度洗脱程序对肽段进行洗脱分离，所述梯度洗脱程序为：0~4min 96%A~94%A，4~100min 94%A~76%A，100~102min 76%A~60%A，102~105min 60%A~20%A，105~110min 20%A，110~110.1min 20%A~95%A，110.1~120min95%A。

2.根据权利要求1所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：数据分析操作还包括：将蛋白序列比对到Gene Ontology Terms数据库，鉴定蛋白的功能；

利用NCBI “blastp”蛋白同源比对将已鉴定蛋白注释到TAIR protein database数据库；

利用KEGG数据库对所鉴定蛋白进行通路分析；

利用COG数据库进行基因的功能注释。

3.根据权利要求1所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述步骤S1还包括通过以下步骤提取得到原生质体：取待提取材料，加入酶液反应完后过滤，收集滤液，离心后弃上清，沉淀即为原生质体；其中，所述酶液的制备方法为取含有质量分数为0.5%~2%的纤维素酶、质量分数为0.05%~0.15%的果胶酶、质量分数为0.05%~0.15%的离析酶和0.3mol/L~0.6mol/L甘露醇的溶液，在50℃~60℃下水浴8min~15min冷却后加入氯化钙和BSA，所述氯化钙的终浓度为0.05mol/L~0.15mol/L和所述BSA在溶液中的质量百分数为0.05%~0.15%。

4.根据权利要求3所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：加酶液后的反应条件为：在室温下避光轻微摇动4 h。

5.根据权利要求1所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：所述步骤S1中提取蛋白总样的操作具体为：用质量分数为6%~10%的甘露醇溶液洗涤后，再用PBS重悬原生质体，加入PMSF混匀后离心，收集上清即为原生质体总蛋白。

6.根据权利要求1至5任一项所述的降低植物小分子信号肽假阳性率的方法，其特征在于：质谱检测过程中，质谱条件为：毛细管电压 3.0 kV；温度 120 ℃；采样锥 60 V；反溶剂温度 350 ℃；流速50 L/h；反溶剂气体流速 500 L/h；扫描在250 ms内获得，以50 ms/次进行扫描；在350-1500 m/z范围内采集MS1光谱，在100-1500 m/z范围内采集MS2光谱。