[发明专利]一种检测鸡或鸭骨骼肌肌钙蛋白I的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种检测鸡或鸭骨骼肌肌钙蛋白I的酶联免疫试剂盒，其特征在于，该酶联免疫试剂盒由包被有捕获抗体的酶标板、酶标记的检测抗体、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液组成；所述捕获抗体由保藏编号为CCTCC NO:C202003的杂交瘤细胞株skTnI-3E7分泌得到，该细胞株于2019年12月10日送交中国典型培养物保藏中心 (CCTCC) 保藏；所述检测抗体为抗鸡骨骼肌肌钙蛋白I兔源多克隆抗体；所述酶标记检测抗体，其采用本领域常规的酶标记方案；所述酶标记的检测抗体中标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述显色底物包括显色底物A和显色底物B，所述显色底物A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色底物B为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1-2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酶时，所述显色底物为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1-2mol/L氢氧化钠。

2.一种制备权利要求1所述的酶联免疫试剂盒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备包被有捕获抗体的酶标板：

（a）用包被缓冲液将捕获抗体稀释成1:2000，100ul/孔加入到酶标板孔内；

（b）4℃过夜或37℃孵育2h，倾去孔中液体，洗涤液洗涤4-5次，拍干；

（c）加入封闭液缓冲液，200ul/孔，37℃孵育2h；

（d）倾去孔中液体，拍干，室温在真空干燥箱中抽干5h，用铝箔袋真空塑封，即得包被有捕获抗体的酶标板；

其中，所述包被缓冲液为pH9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭缓冲液为1%的明胶；

（2）制备酶标记检测抗体工作液：

将辣根过氧化物酶与检测抗体采用碘酸钠法进行偶联；

（3）组建用于检测鸡或鸭骨骼肌肌钙蛋白I的酶联免疫试剂盒，包括下述各组分：

（a）包被有捕获抗体的酶标板；

（b）酶标记检测抗体工作液；

（c）底物显色液A液为过氧化脲溶液，底物显色液B液为四甲基联苯胺（TMB）溶液；

（d）终止液为1-2mol/L的硫酸溶液；

（e）浓缩洗涤液为含有1%吐温-20的0. 2mol/L PH7.4的磷酸盐缓冲液。

3.权利要求1所述的酶联免疫试剂盒用于检测生鲜肉及其制品中鸡或鸭骨骼肌肌钙蛋白I的应用，包括如下步骤：

（1）样品前处理

生鲜肉类去除脂肪和结缔组织，加工肉类食品去掉肠衣，称取1g加入0.15M的NaCL溶液2ml，匀浆后用沸水加热20min，2000g离心30min；去除沉淀，上清用Whatman 1号滤纸过滤，收集滤液用于检测；

（2）使用试剂盒进行检测

取出所述的酶联免疫试剂盒，试剂恢复至室温20-25℃，在室内放置30min以上；按需要取出板条，放置在酶标板上；向孔内依次加入标准品或待测样品100ul，轻轻振荡混匀，37℃避光孵育30min；将孔内液体甩干，将洗涤工作液用去离子水将20×浓缩洗涤液20倍稀释后，250ul/孔，洗涤4次，拍干；加入稀释的酶标记检测抗体工作液100 ul，轻轻振荡混匀，37℃避光孵育30min；将显色液A和显色液B按体积比1:1比例混合，100ul/孔加入显色，25℃避光孵育15min；加终止液50ul终止反应，酶标仪450nm下测定；

（3）分析检测结果

结果判定：

（a）定量分析：分别计算标准品和待测样本的平均吸光度值，标准品的吸光度值为纵坐标，添加浓度为横坐标，绘制标准曲线；将待测样本的吸光度值代入标准曲线，即可求出对应的浓度，再乘以稀释倍数即为样本的含量；

（b）定性分析：用待测样本的平均吸光度值和标准品的吸光度值相比较，即可得出待测样本的浓度范围。