[发明专利]一种肝脏特异性启动子及其应用

说明书

本发明属于基因治疗领域，更具体地，涉及一组肝脏特异性启动子及其应用。本发明公开了一组调控基因在肝脏系统特异性高表达的小尺寸的重组核酸序列。所述重组调控序列片段与目前所报道的相近尺寸大小的其他序列相比，驱动报告基因和人凝血因子FVIII在肝脏系统中表达能力明显增强，适用于重组腺病毒伴随病毒(rAAV)介导的基因治疗。

技术领域

本发明属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种肝脏特异性启动子及其应用。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或异常引起的疾病，最终实现治疗目的。从1989年人类首个基因治疗方案进入临床试验算起，已有着超30年的发展历史。虽然过程颇为坎坷，但是随着载体病毒、递送机制的优化，近年来，基因治疗得以迅猛发展，在癌症、罕见病治疗上展现出很好的前景。仅2017年，基因治疗就取得了多项里程碑突破，美国FDA先后批准两款CAR-T疗法(Kymriah和Yescarta)和首款“靶向遗传学眼疾突变”的基因疗法(Luxturna)，可以称得上是基因疗法“厚积薄发”的一年。

腺病毒伴随病毒(AAV)属于细小病毒科，是一类病毒颗粒小、复制缺陷、无包膜的病毒，迄今尚未发现野生型AAV对人体致病。经人工改造的重组AAV(rAAV)具备安全性好、免疫原性低、组织嗜性广泛、不整合到宿主细胞基因组等优点，近年来，用rAAV作基因治疗载体已成为基因治疗研究的热点。早在2012年，欧洲药监局就批准了第一个基因治疗药物——基于rAAV载体的脂蛋白酯酶基因治疗药物Glybera；2017年12月19日，美国FDA批准了第一个罕见病基因治疗药物Luxturna，用以治疗先天性黑曚症(RPE65基因突变引起)，该药物也是以rAAV作为基因治疗载体；2019年5月24日，美国FDA又批准了诺华旗下的治疗I型重症肌萎缩症(SMAI)的罕见病基因治疗药物Zolgensma。截止2019年11月份，在ClinicalTrials.gov上注册以rAAV为载体的基因治疗临床试验方案多达200多项(ClinicalTrials.gov)。

重组AAV作为基因治疗载体也存在明显缺点，其装载外源基因的容量较小，单链基因组AAV装载外源基因的上限为4.7kb，装载外源基因长度的进一步增加，病毒颗粒包装的完整性随之下降。由于装载量的限制，一些较大的基因并不适合用rAAV载体进行递送，如A型血友病致病基因凝血因子Ⅷ，其cDNA大小为7056bp，编码2351aa的FⅧ前体蛋白，远超出rAAV的装载容量。

血友病(hemophilia)是凝血因子缺乏导致的一类遗传性凝血功能障碍疾病，常见类型包括血友病A(HA)和血友病B(HB)。以血友病的发病率为5～10/10万估算，预计目前我国的血友病患者人数达10万左右，全球大约100万人。

HA由位于X染色体上的FⅧ(F8)基因突变造成凝血因子八缺乏或功能缺陷导致，约占全部血友病的80％。HB表现为凝血因子Ⅸ(FⅨ)缺乏，约占全部血友病患者的20％，由位于Ⅹ染色体上的FⅨ(F9)基因突变引起。

目前治疗血友病的主要方法是替代治疗。替代治疗是通过输注外源性重组凝血因子以缓解其出血并发症，防止功能丧失。但由于凝血因子Ⅷ半衰期较短(8-12h)，每周需注射2-3次，频繁的治疗严重影响了患者的生活质量。而基因治疗为血友病以及其他一些单基因遗传病的治疗提供了一条新的路径。血友病基因治疗是将外源正常编码凝血因子的基因导入患者体内，并在细胞内表达和分泌治疗水平的凝血因子，从而实现彻底治愈血友病的目的。凝血因子Ⅷ并不需要补充到正常水平发挥功能，只需要恢复到正常水平的5％即能达到预防出血的效果，使得血友病A成为一种很好的基因治疗适应症。