[发明专利]一种短小型小核RNA启动子及其构建方法和在基因组编辑中的应用

说明书

本发明提供了一种短小型小核RNA启动子及其构建方法和应用。所述短小型小核RNA启动子的长度为150‑300bp，3’端至5’端方向依次含有1个TATA box保守元件，1个USE保守元件，以及至少一个MSP保守元件。相比现有野生型小核RNA基因启动子，本发明所构建的短小型小核RNA启动子转录活性更强，具有明显更高的驱动sgRNA的编辑效率，而且长度较短，可以减少每个sgRNA表达盒的长度，提高多靶点sgRNA克隆构建载体的效率，利于进行多靶点多基因的同时编辑，在基因组编辑方面具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域。更具体地，涉及一种短小型小核RNA启动子及其构建方法和在基因组编辑中的应用。

背景技术

近年以来，以CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑技术以及其多种衍生基因编辑系统(如单碱基编辑器)发展迅速，在动物、植物等多种生物得到了广泛应用。CRISPR/Cas9系统需要表达Cas9蛋白和单导向RNA(single guider RNA，sgRNA，其5’含有约19-21碱基的特异靶点序列)，它们结合成Cas9/sgRNA复合体靶向目标基因的靶点序列，由Cas9对靶点DNA进行切割产生双链断裂，并诱发DNA修复时产生碱基变异，达到基因特异突变的目的。如果在受体生物细胞同时表达或导入多个不同靶点的sgRNA，就可以同时进行多靶点编辑(Conget al.,2013,Science 339:819-823)，达到同时突变多个基因的目的。

在植物中以CRISPR/Cas9进行基因组编辑，通常需要构建表达Cas9蛋白和转录sgRNA的表达盒的转化载体，如以农杆菌介导转化的双元载体。通常用于驱动sgRNA转录的启动子为小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)基因如U3和U6的启动子，因为snRNA基因启动子利用RNA聚合酶III进行转录，所产生的RNA(sgRNA)存在于细胞核中，利于引导Cas9到核基因组靶点对靶序列进行切割。植物U3、U6启动子在近3’端含有一个保守的TATA box元件，紧接其5’上游有一个保守的USE(upstream sequence element)元件，以及在USE上游区域分散存在3～4个MSP(monocot-specific promoter element,RGCCCR,R＝G,A)；这些保守元件是U3、U6启动子活性所必需的，其中TATA box和USE的相对位置较固定(间隔24-25bp)，但USE上游区域的多个MSP的位置不确定(Connelly et al.,1994,Molecular CellBiology 14:5910-5919)。