[发明专利]用于蛋白质表面固定的多肽及应用

说明书

本发明公开了一种具有二氧化硅结合活性的多肽，所述多肽含有构成多肽主体部分的二氧化硅结合单元以及在多肽的N‑末端或者C‑末端至少一个组氨酸残基组成的氢键形成单元。本发明还公开了含有上述多肽和具有生物学效应的功能蛋白质的融合蛋白，以及一种蛋白质固定方法。本发明提供的融合蛋白通过与定向控制的非共价结合，使相关蛋白简单、快速、一步固定到硅基表面。在高盐、极端pH和变性条件下，蛋白质的结合保持稳定，肽固定化既不需要表面修饰，也不需要化学偶联，可以以较低的成本制备融合蛋白。此外，由于二氧化硅结合肽融合到亲本蛋白的一个特定末端，蛋白的结合位点受到控制，消除了活性位点的空间位阻。

技术领域

本发明涉及蛋白质的固定方法，具体地，本发明涉及：(1)融合蛋白的制备，所述融合蛋白含有能够结合以二氧化硅为基质的材料(石英、玻璃)的多肽。(2)固定所述融合蛋白的方法。更具体地，本发明涉及上述的蛋白质和方法，其中所述蛋白质为酶、抗体、抗体片段或抗原。

背景技术

在生物分析工具的设计和制备中，功能蛋白在固体基质上的固定是一个具有重要商业价值的方法(VijayendranLeckband,2001；Weetall,1993；Wu,Chen,Liu,2009)。以诸如酶、抗体、抗体片段、抗原等高价值蛋白使表面具有功能化是设计与制造生物活性装置的基本方法，该方法被越来越多的应用于生物传感、纯化、解毒、催化等工业领域。

诸如石英和玻璃等以二氧化硅(silica)为基质的材料具有各种不同的形式，平滑表面(CoyleBaneyx,2014)，纳米粒子(Ikeda et al.,2011)，微球(Johnson,Zawadzka,Deobald,Crawford,Paszczynski,2008)，纳米颗粒以及硅基表面因其丰富、低成本和生物相容性而成为蛋白质最常用的固体基质。虽然吸附或化学交联可以用来固定高价值的蛋白质。改进的方法包括使用重组结合的二氧化硅结合肽。整合有二氧化硅结合肽的融合蛋白可以通过强非共价相互作用附着在硅基表面，这种固定化方法不需要使用化学交联剂。

通常，蛋白质在硅基材料上的固定是基于非特异性吸附或化学偶联的原理。吸附到固体表面通常伴随着显著的构象破坏和相关蛋白的部分展开和变性(Hartmann,2005；Lundqvist,Sethson,Jonsson,2004；Roach,Farrar,Perry,2006)。对于化学偶联法，通过对表面进行化学修饰实现蛋白质的固定(Chen,Kong,Yuan,Fu,2014；Wang,Rabe,Ahmed,Niemeyer,2015)，既可以使用功能性硅烷醇(例如3-氨丙基三乙氧基硅烷)进行表面处理或使用活性化学交联剂(例如戊二醛)。因此，这种方法有以下缺点:(1)需要使用有害化学品，(2)需要额外的反应步骤，这会增加固定过程的时间和成本，(3)不受控制的固定方向可能会损害蛋白质的功能。例如，抗体的结合位点可能在化学交联过程中被阻断，因为这种结合不是位点特异性结合。

开发一种快速、低成本、可控的目的蛋白质固定方法具有重要意义。本发明的目的就是提供一种具有二氧化硅结合活性的多肽，以使含有这些肽的融合蛋白通过与定向控制的非共价结合，使相关蛋白简单、快速、一步地被固定到硅基表面。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种具有二氧化硅结合活性的多肽，所述多肽含有构成多肽主体部分的二氧化硅结合单元以及在多肽的N-末端或者C-末端至少一个组氨酸残基组成的氢键形成单元。

本发明是基于发现在融合蛋白中引入多聚组氨酸片段能够促进二氧化硅与肽结合的效率，该多聚组氨酸片段在二氧化硅表面能够与硅醇基团形成氢键。