[发明专利]一种生物靶向抗菌的DspB固定酶及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种生物靶向抗菌DspB固定酶的制备方法，该制备方法利用戊二醛，或多巴胺，或丁二酸酐对磁性纳米材料进行末端修饰，然后，通过迈克尔加成反应使DspB共价固定到末端醛基修饰、末端聚多巴胺修饰或末端羧基修饰的MNPs颗粒表面，使得所制的生物靶向抗菌DspB固定酶具有良好的分散性、稳定性、磁响应性和酶活性，且其具备的磁响应性使其易于富集和分离，或进行定向移动定位，从而使其可在外加磁场下使DspB酶在目标局部形成相对较高的浓度，进而大大提高其药效，且保证其具有较高的循环使用效率。

技术领域

本发明涉及生物靶向抗菌材料技术领域，特别涉及一种生物靶向抗菌DspB 固定酶及其制备方法和应用。

背景技术

生物被膜是微生物为适应环境，提高自身生存力而形成的特殊膜层结构。而由细菌细胞以及细菌分泌的包裹着细菌的胞外基质组成的生物被膜，可以保护细菌不被宿主免疫系统识别和清除，而抗生素类药物由于生物被膜的阻碍无法接触到致病菌，也达不到预期的杀菌效果。形成生物膜几乎是所有细菌的能力。

DspB酶作为糖苷水解酶家族20蛋白，其催化降解聚β-(1,6)-N-乙酰葡萄糖胺(poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine,PNAG)的β-(1,6)糖苷键，而GH20家族其他蛋白质能水解N-乙酰氨基葡萄糖残基之间的β-(1,4)糖苷键。生物被膜中的细菌是包被于自身合成的细胞外多糖基质中，而这些基质主要成分是由β-(1,6)糖苷键连接而成的PNAG，因此，可以被DspB降解生物被膜而形成游离状态的细胞，方便机体免疫系统的识别以及抗生素的渗透与扩散。

目前，现有的糖苷水解酶(DspB)普遍存在以下两个问题：一是蛋白酶普遍在较长时间内不能保持持续稳定的活性，二是β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(DspB)制备方法复杂繁琐、周期长、产量低。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种生物靶向抗菌DspB固定酶的制备方法，以解决现有糖苷水解酶稳定性和活性较低的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种生物靶向抗菌DspB固定酶的制备方法，包括以下步骤：

1)磁性纳米材料的制备：将铁盐与亚铁盐反应，得到具有超顺磁性的Fe₃O₄纳米粒子后，再加入正硅酸四乙酯反应，生成具有核壳结构的磁性纳米材料A；

2)磁性纳米材料的修饰：对所述磁性纳米材料A进行末端醛基修饰，或末端聚多巴胺修饰，或末端羧基修饰，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B；

3)糖苷水解酶的固定：将所述磁性纳米材料B重悬于用磷酸缓冲盐溶液稀释的糖苷水解酶酶液中，进行迈克尔加成反应，得到生物靶向抗菌DspB固定酶。

可选地，所述步骤1)中所述铁盐与所述亚铁盐的摩尔比为(1.5～2.5)∶1。

可选地，所述步骤2)中对所述磁性纳米材料A进行末端醛基修饰，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B，包括：

向所述磁性纳米材料A中加入硅烷偶联剂，在80℃下回流冷凝4-8h，进行氨基化修饰反应，待所述氨基化修饰反应结束后，加入戊二醛，于40℃下搅拌 10-24h，进行醛基修饰反应，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B。

可选地，所述步骤2)中对所述磁性纳米材料A进行末端聚多巴胺修饰，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B，包括：

在pH为8.5的Tris-HCl缓冲液中，将所述磁性纳米材料A与多巴胺混合后，于25℃水浴下搅拌10-18h，进行聚多巴胺修饰反应，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B。

可选地，所述步骤2)中对所述磁性纳米材料A进行末端羧基修饰，得到固定糖苷水解酶的磁性纳米材料B，包括：