[发明专利]一种甘蔗黄叶病毒运动蛋白表达纯化方法及其多克隆抗血清的制备

权利要求书

1.一种甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV)运动蛋白(ScYLV-MP)表达纯化方法，具体步骤为：

(1)ScYLV-MP基因的调取及扩增；

(2)ScYLV-MP基因原核表达载体构建；

(3)His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的原核表达；

(4)His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的纯化。

2.根据权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于：所述ScYLV-MP基因的调取及扩增是以含有ScYLV运动蛋白基因全长的克隆质粒为模板，以5'-CATATGTCAGAAGACGCGCTAACCGT-3'(下划线为限制性内切酶Nde I的识别位点)和5'-CTCGAGTAAAGTCTTTCCCCCTG-3'(下划线为限制性内切酶Xho I的识别位点)为引物进行PCR扩增。

3.根据权利要求1-2任一项所述的表达纯化方法，其特征在于：所述ScYLV-MP基因原核表达载体构建是将步骤(1)中得到的PCR扩增产物和克隆载体pMD19-T进行连接，得到重组质粒pMD19-T-ScYLV-MP，用限制性内切酶Nde I和Xho I进行酶切，回收酶切片段，取载体pDB.His.MBP，用限制性内切酶Nde I和Xho I进行酶切，回收载体骨架，将所述酶切片段和所述载体骨架进行连接，得到重组质粒pDB.His.MBP-ScYLV-MP。

4.根据权利要求1-3任一项所述的纯化表达方法，其特征在于，所述His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的原核表达是将步骤(2)中获得的原核表达载体导入大肠杆菌Rosseta中，得到重组菌Rosseta-ScYLV-MP，取Rosseta-ScYLV-MP单克隆，接种培养至OD_600nm值为0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，18℃、180rpm振荡诱导培养18h，4℃、5000rpm离心6min，收集菌体沉淀，重悬后超声破碎，收集上清液。

5.根据权利要求1-4任一项所述的纯化表达方法，其特征在于，所述His-tag-(ScYLV-MP)融合蛋白的纯化是将步骤(3)中获得的上清与Ni亲和层析柱结合，再用不同浓度咪唑洗脱液洗脱蛋白。

6.根据权利要求1-5任一项所述纯化表达方法所获得的ScYLV-MP蛋白，其特征在于，所述ScYLV-MP蛋白具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求1-5任一项所述纯化表达方法所获得的ScYLV-MP蛋白在在制备多克隆抗血清中的应用，其特征在于，所述ScYLV-MP蛋白具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

8.一种用于甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV)检测的试剂盒，所述试剂盒包括：由权利要求1-5任一项所述纯化表达方法所获得的ScYLV-MP蛋白所制备获得的多克隆抗血清，所述ScYLV-MP蛋白具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。