[发明专利]一种子宫内膜干细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了干细胞培养相关技术领域的一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括干细胞原料获取、原代培养、P1代细胞培养、Pn代细胞培养等步骤，还可以包括冷冻保藏步骤；通过本发明的技术方案分离培养的子宫内膜干细胞迁移能力强；具有多向分化潜能；在体外能够快速扩增；能够从P1持续培养，尽量延长干细胞传代代数，克服传代代数少，需要从子宫内膜取材的限制。

技术领域

本发明涉及干细胞培养相关技术领域，特别涉及一种子宫内膜干细胞的分离培养方法。

背景技术

干细胞是一种具有自我复制与自我更新能力，并且能够多向分化的细胞。正是由于干细胞的这些特性，近年来已成为疾病治疗和组织工程领域理想的材料。

由于人类子宫内膜功能层在月经周期内受内激素的作用发生周期性的增生和脱落，研究表明，子宫内膜之所以具有如此强大的再生能力，与其中包含的干细胞密不可分。越来越多的研究也将精力投入这一领域。从体外分离培养子宫内膜干细胞，然后移植于机体内，为干细胞培养提供了一种切实可行的途径。

但是，由于子宫内膜干细胞的复杂性与稀少性，严重制约了子宫内膜干细胞的研究，并且制得的干细胞的纯度低、数量少，无法摆脱对子宫内膜原材料直接来源的限制。因而，研发一种能够从P1持续培养，尽量延长干细胞传代代数的子宫内膜干细胞的分离培养方法，是现有技术迫切需要解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的制得的干细胞的纯度低、数量少，无法摆脱对子宫内膜原材料直接来源的限制的技术问题，本发明提供一种子宫内膜干细胞的分离培养方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

S1)干细胞原料处理：向经血原料中加入所述经血原料体积1～2倍的PBS充分混匀，然后缓慢加入到等体积的分离液中，在2000-2500r/min下离心获得中间层，然后经过50～200目细胞滤网过滤，将得到的滤液在1000～1200r/min下离心弃上清，得细胞沉淀；

S2)原代培养：向S1)制得的所述细胞沉淀中加入生理盐水中进行重悬，得到第一单细胞悬液，将所述第一单细胞悬液按照4～5×10⁴个/mL的浓度接种于第一原代培养基中，在37±1℃条件下体积分数为5±0.2％CO₂的饱和湿度的培养箱中培养6～12h，将未贴壁细胞移入第二原代培养基后继续培养，待所述第一原代培养基或所述第二原代培养基中的细胞融合至85～90％时分别收获细胞，将得到的细胞均标记为P0代细胞；其中，4～5×10⁴个/mL指的是4×10⁴个/mL至5×10⁴个/mL，具体实施例中有详细数据，其他涉及细胞计数的与此相同，不再赘述；

S3)P1代细胞培养：将S2)制得的所述P0代细胞加入生理盐水中进行重悬，得到第二单细胞悬液，然后将所述第二单细胞悬液按照4～5×10⁴个/mL的浓度加入到传代培养基中，在37±1℃条件下，在体积分数为5±0.2％CO₂的饱和湿度的培养箱中培养至细胞融合度达到85～90％，弃除未贴壁细胞收获细胞，将得到的细胞标记为P1代细胞；

S4)Pn代细胞培养：取P1代细胞接种至所述传代培养基中，并每天向所述传代培养基中加入所述传代培养基重量3～5％的增活剂，待所述P1代细胞生长达到90～95％融合时收集细胞，按照本步操作继续培养至P5～15代，即得所述子宫内膜干细胞的传代培养细胞。

进一步的，S2)中所述第一培原代养基为包括体积浓度为8～12％的FBS、2～5％的甘露醇、2～5％的SOD，以及8～16ng/mLEGF和8～16ng/mLPDGF-BB的DMEM/F12培养液。