[发明专利]基于人工油体制备固定化多酶生产肌醇技术

说明书

本发明是一种基于人工油体同步纯化和固定化肌醇制备的多酶的方法，该方法是利用人工油体将表达的目标蛋白酶‑油体蛋白的融合蛋白与油体按照比例混合，超声处理，通过人体蛋白的特异疏水性将融合蛋白锚定到油体表面，形成含有目标蛋白酶的人工油体，从而实现酶的纯化和固定化同步完成。该发明提供了一种全新的可用于肌醇生产的多酶固定化技术，降低了当前酶法制备肌醇的生产成本，制备工艺简单。本发明首次采用人工油体作为固定化酶基质，成本低廉、底物适应性广泛，并显著提高固定化酶的稳定性。

技术领域

本发明涉及一种以基因工程的方法表达蛋白酶，并使用人工油体作为固定化酶基质以制备固定化多酶生产肌醇的方法。

技术背景

1.酶法制备肌醇

肌醇又名环已六醇，是水溶性维生素B族中的一种。肌醇是人、动物与微生物生长的必需物质，广泛应用于医药、食品、饲料等行业。目前全球的需求量大概在每年10， 000吨左右，由于目前肌醇的高售价，使得肌醇的市场前景还未得到充分的开发，例如2013年全球饲料产量为9.6亿吨，如果都加入0.2-0.5％的肌醇，那么饲料工业所需肌醇的产量应该达到每年190-480万吨。在这种情况下，目前中国国内，甚至全世界的产量都远远不能满足需求,目前肌醇的生产主要还是传统的高温加压水解植酸(六磷酸肌醇)，然后利用离子交换方法等去掉植酸水解产生的磷酸盐等。该工艺设备材质要求严格，由于离子交换树脂需要定期再生而造成大量的酸性或者碱性溶液排放进入环境，同时排出大量的磷酸盐，环境污染严重。CN106148425A针对肌醇制备提供了一种肌醇的酶催化转化方法，通过体外多酶催化淀粉以及淀粉衍生物生产肌醇，该方法原料转化率高，肌醇产率高，步骤简捷，对环境影响小，可实现肌醇的规模化生产。但是该方法中多个酶分子需要经过繁琐的提取和纯化才能得到，代价较昂贵；而且这些水溶性酶分子在催化结束后较难回收，造成浪费。

2.固定化酶

固定化酶是用物理或化学手段.将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。将酶固定在载体上催化反应合成所需产物，使昂贵的蛋白酶得以重复使用，降低反应成本。且固定化酶具有可回收，重复使用，稳定性高，产品质量高等优点。酶固定化方法可分为物理法(吸附法和包埋法) 和化学法(共价结合法)。但这些方法都存在一定的缺陷：物理法制备固定化酶具有操作简单，成本较低的优点，但达不到纯化的目的，而且包埋法只适用于分子量较小的底物和产物的催化反应；化学法制备的固定化酶具有结合牢固，不易脱落，可连续使用较长时间的优点，但在固定化过程中不可避免地导致酶部分活性位点的损失，降低酶的活力。此外，酶固定化必须对蛋白酶进行一定的分离提纯才能获得较高的固定化效率，使得固定化酶的生产成本较高，限制其在实际生产中的应用。

发明内容

本发明的目的在于利用人工油体同步纯化和固定化蛋白酶，该发明提供了一种全新的酶固定化技术用于肌醇的生产，降低了当前酶法制备肌醇的生产成本，制备工艺简单。

本发明的特征在于该方法步骤如下：利用基因合成的方法合成油质蛋白基因。根据专利CN106148425A的方法获得肌醇制备所需多酶的蛋白基因。利用基因工程的方法构建油体蛋白和各个目标蛋白酶表达载体。将表达载体转入表达宿主菌E.coli BL 21(DE3)中，获得用于表达融合蛋白的工程菌株。将诱导表达的工程菌株超声破碎，获得融合蛋白；将获得的融合蛋白单独或按照比例均匀混合后与油体，卵磷脂按比例混合超声处理，利用油体蛋白的特异疏水性使融合蛋白锚定到新组成的人工油体上，形成含有目标蛋白酶的人工油体，即固定化酶。

所述的固定化酶是用人工油体固定化的酶，用于制备肌醇。

所述的融合蛋白是肌醇制备所需的多个融合蛋白，包括葡聚糖磷酸化酶-油脂蛋白融合蛋白，葡萄糖磷酸变位酶-油脂蛋白融合蛋白，肌醇-3-磷酸合成酶- 油脂蛋白融合蛋白和肌醇单磷酸酶-油脂蛋白融合蛋白。

所述的诱导表达的工程菌株超声破碎的条件条件为：功率40-60％；破碎时间5-15min。