[发明专利]一种提取沉水植物龙舌草原生质体方法

说明书

本发明公开了一种提取沉水植物龙舌草原生质体方法，其步骤是：A、配制母液：B、配制工作液：(1)消化酶溶液配制10mL消化酶母液的量；(2)W5溶液配制100mL母液的量；(3)MMG溶液配制100mL母液的量；C、用具准备：剪掉头部的蓝枪头、二套干净的培养皿、长方形的刀片、2mL圆底离心管；D、酶解细胞壁：将龙舌草叶片浸于装有山梨醇溶液的培养皿中，沉入酶解液中；E、富集原生质体；F、保存原生质体：去除上清液，将原生质体沉淀移入一管注入MMG溶液保存，得一种原生质体。方法易行，操作简便，简单快速，无需复杂的纯化即可获得较为纯净的原生质体。将收集到的原生质体重新悬浮到保存液中，可稳定保存24h以上。适用于提取沉水植物的原生质体。

技术领域

本发明属于生物技术细胞生物学领域，更具体涉及一种提取沉水植物龙舌草原生质体方法，适用于从沉水植物叶片中提取原生质体。

背景技术

沉水植物龙舌草是水鳖科海菜花属植物，广泛分布于东亚各国。虽然龙舌草叶片解剖结构简单，仅具有两三层细胞，但是其叶片能够进行C4代谢，为单细胞C4代谢植物。同时还可以诱导出景天科酸代谢途径(CAM)，并且能够利用水体中的碳酸氢根作为无机碳源进行光合作用，能有效的应对水体中多变的无机碳环境。研究不同光合碳利用途径在龙舌草单细胞中共存机制，不但有利于加深对光合作用途径的理解，而且有可能为改造农作物光合途径，增强碳同化能力，增加农作物产量提供理论基础。但是，龙舌草并非生物学研究中的模式植物，龙舌草的转基因体系尚未建立，而基于单细胞培养是建立转基因体系的一种有效途径，因此分离和提取龙舌草的原生质体成为转基因体系建立的关键步骤之一。本发明是在植物原生质体分离的常规技术基础上，针对龙舌草对部分试剂成分进行了优化调整而得到的。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种提取沉水植物龙舌草原生质体方法，方法易行，操作简便。其优点在于简单快速，无需复杂的纯化即可获得较为纯净的原生质体。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

其技术构思是：利用纤维素酶和离析酶降解细胞壁并释放原生质体。利用山梨醇作为渗透物质，配制一定浓度的纤维素酶和离析酶的酶解液，在25到30℃条件下降解细胞壁。使用略微高渗的溶液，加入到酶解液中终止酶解，释放原生质体到原生质体中。过滤去除未降解的碎片，收集含有原生质体的滤液，离心，富集原生质体。再用略微高渗的溶液重新悬浮，离心，收集原生质体。将收集到的原生质体重新悬浮到保存液中，可稳定保存24h以上。本发明主要针对沉水植物龙舌草开发的一种快速提取原生质体的简便方法，适用于提取沉水植物的原生质体。本发明利用纤维素酶和离析酶降解细胞壁，并使用山梨醇作为渗透物质，保持原生质体的完整性。

一种提取沉水植物龙舌草原生质体方法，其步骤是：

①配制母液：

1M山梨醇:18.2g溶于双蒸水中，定容到100mL(常温常压下进行)；

0.2M氯化钾：1.49g溶于双蒸水中，定容到100mL(121℃高压灭菌)；

1M氯化钙:11.1g溶于双蒸水中，定容到100mL(121℃高压灭菌)；

0.5M氯化镁:4.76g溶于双蒸水中，定容到100mL(121℃高压灭菌)；

1.54M氯化钠:8.99g溶于双蒸水中，定容到100mL(121℃高压灭菌)；

0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES):1.95g溶于双蒸水中，定容到100mL，PH值调到5.7(121℃

高压灭菌)。

注意：山梨醇非常容易长菌，使用时用0.21μm滤膜过滤灭菌(通常使用的121℃高温高压灭菌对其成分可能有损害)，每次使用时可以减少总配制量，现配先用。其他试剂高温灭菌(121℃)后可以多次(3－5次)使用。