[发明专利]一种提取沉水植物龙舌草原生质体方法

权利要求书

1.一种提取沉水植物龙舌草原生质体方法，其特征在于，其步骤是：

A、配制母液：

1M山梨醇:18.2g溶于双蒸水中，定容到100mL，常温常压下进行；

0.2M氯化钾：1.49g溶于双蒸水中，定容到100mL，121℃高压灭菌；

1M氯化钙:11.1g溶于双蒸水中，定容到100mL，121℃高压灭菌；

0.5M氯化镁:4.76g溶于双蒸水中，定容到100mL，121℃高压灭菌；

1.54M氯化钠:8.99g溶于双蒸水中，定容到100mL，121℃高压灭菌；

0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸:1.95g溶于双蒸水中，定容到100mL，PH值调到5.7121℃高压灭菌；

B、配制工作液：

(1)消化酶溶液配制10mL消化酶母液的量:

(2)W5溶液配制100mL母液的量:

(3)MMG溶液配制100mL母液的量:

C、用具准备：剪掉头部的蓝枪头、二套干净的培养皿、长方形的刀片、2mL圆底离心管；

D、酶解细胞壁：将龙舌草叶片切成2cm宽4cm长的小块浸于装有0.3M山梨醇溶液的培养皿中，用刀片划成1mm宽的丝，手感到有阻滞就换一个刃口，全程在0.3M山梨醇溶液中进行，将切好的叶片用解剖针挑至有20mL酶解液的锥形瓶中，叶片悬于酶液中，将锥形瓶抽真空3-5分钟，沉入酶解液中，在25-30℃下避光酶解3-4h；

E、富集原生质体：酶解好后注入20mL预冷W5：154mM氯化钠，125mM氯化钙，5mM氯化钾和2mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸，溶液终止酶解，用100目的纱布过滤；滤出液体分装入四支10mL离心管中4摄氏度100g加减速8挡离心5min；去除上清将沉淀移入两支2mL离心管中用预冷W5：154mM氯化钠，125mM氯化钙，5mM氯化钾和2mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸，注满，冰浴30min，然后4摄氏度100g加减速8档离心5min；此步骤重复两到三次；

F、保存原生质体：去除上清液，将原生质体沉淀移入一管注入MMG溶液保存，原生质体制备完成，获得一种原生质体，在显微镜下计数，计算原生质体浓度。