[发明专利]一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法

说明书

本发明属于免疫细胞体外培养技术领域，特别公开了一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法。本发明以脐带血为处理对象，经过脐带血单个核细胞的分离，CIK细胞的提纯诱导，CIK细胞的培养扩增，最后离心收集成熟的脐带血CIK细胞，得到产品。本发明通过用添加IFN‑γ和α‑半乳糖神经酰胺对CIK细胞进行激活，培养前期加入CD3单克隆抗体、IL‑1α、IL‑2及IL‑1β连续刺激，省去包被时间，提高效应细胞群活化效率和扩增效率。

技术领域

本发明涉及免疫细胞体外培养技术领域，特别是涉及脐带血淋巴细胞CIK的培养方法。

背景技术

过继性免疫细胞疗法是将具有特异免疫力的淋巴细胞或其产物输给细胞免疫功能失调(如肿瘤病人以及免疫力过高或过低导致的其他疾病)，调节患者抗肿瘤免疫力，以达到治疗和预防复发的目的。

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells，CIK )是将人外周血或者脐带血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2、α-半乳糖神经酰胺、IL-1β和IFN-γ等 )诱导增殖后获得的一群异质细胞。由于其同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，又被称为NK细胞样T淋巴细胞，同时具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。然而NKT细胞在正常的脐带血中含量极低，仅为1％左右。因此，在体外培养中，提高CIK细胞的数量及其效应细胞NKT细胞的比例对提高临床治疗效果有着至关重要的作用。

有研究表明，脐带血来源的CIK细胞和外周血来源的CIK细胞相比，有更高的增殖能力、更强的杀伤肿瘤活性和较低的免疫原性。

肿瘤细胞的免疫逃逸性就是指肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统识别和攻击，从而适得其在体内生存和增殖。机体免疫系统具有免疫监视功能，当体内出现恶变细胞时，免疫系统能够识别并通过免疫机制特异地清除这些异常细胞，抵御肿瘤的发生和发展，进而使正常人躲避肿瘤的发生。然而，恶变细胞在一定情况下能通过多种机制逃避机体的免疫监视，在体内迅速增殖，形成肿瘤。总的来说，一方面，机体可通过机体免疫抵抗肿瘤的发生；另一方面，肿瘤细胞在增殖的过程中发生变异同时通过多种机制逃避机体免疫的识别和攻击。对于免疫T细胞包括 CIK细胞，其分子机理在于其细胞表面表达着一类受体，它们的作用是一旦与其肿瘤或其他想逃避免疫识别和攻击的细胞的相应配体结合，就能产生一系列信号来抑制或削弱T细胞的活力。而这种逃避免疫识别和攻击最先是生物体用来控制T细胞的避免杀伤自身细胞而产生自身免疫反应。因此对于肿瘤患者或免疫性疾病的患者来讲，自身的免疫细胞CIK扩增进入体内后仍然会因为癌细胞等靶细胞的免疫逃避机制而表现出低杀伤或无杀伤能力，而脐带血免疫细胞CIK虽然也有靶细胞躲避杀伤的受体，但因为异体错配而使得机体的癌细胞或靶细胞无法逃脱脐带血CIK免疫识别和杀伤，进而使得脐带血免疫细胞CIK杀伤能力较自体免疫细胞CIK强。

目前现有的CIK技术的不足：

(1 )一般的CIK制备方法是将分离的脐带血单个核细胞( PBMC )用IFN-γ处理24小时后，加入CD3单抗，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的CIK细胞，但最终获得的CIK细胞的增值倍数和有效细胞含量都不够理想。

(2)现有CIK细胞培养前需去除贴壁的单核细胞，步骤较为繁琐且在细胞转移培养的过程中增加了染菌的风险。

(3)自体免疫细胞CIK容易容易引起癌细胞或靶细胞免疫逃逸而降低或失去杀伤癌细胞癌细胞或靶细胞。

发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种通用使用、步骤简单、有效细胞含量多的脐带血淋巴细胞CIK的培养方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种脐带血淋巴细胞CIK的培养方法，以脐带血为原始材料，其特征为，包括如下步骤：