[发明专利]一种绵羊多胎性状的ELISA快速检测方法和应用

说明书

本发明提供了绵羊多胎性状的ELISA快速检测方法和应用，涉及绵羊多胎检测技术领域，利用分子生物学、生物化学及免疫学的方法对绵羊FecB基因进行真核表达、单克隆抗体制备，构建绵羊FecB基因间接ELISA快速检测方法；通过克隆FecB基因编码区序列，真核表达FecB基因表达产物，运用抗体重组技术获得FecB基因表达产物的单克隆抗体，最终建立一种检测绵羊多胎性状的基于单克隆抗体的间接ELISA检测体系，并用于青海地区绵羊多胎性状的快速检测。经验证，本发明所述方法重复性好，灵敏度高。

技术领域

本发明属于绵羊多胎检测技术领域，具体涉及一种绵羊多胎性状的ELISA快速检测方法和应用。

背景技术

我国是世界上绵羊的主要生产国，饲养绵羊数量和绵羊品种遗传资源均居世界第一位。在青海省乃至全国农牧区，养羊业已成为重要产业和主要经济来源。繁殖性能是绵羊重要的经济性状，其中产羔性能是影响生产效率的最主要因素，直接影响到养羊业生产的效率和成本，对养羊业的发展起到了关键性的作用。绵羊产羔性状分为单羔性状、双羔性状和多羔性状3种，不同品种间、同品种不同个体间的产羔率差异较大。研究已证明FecB基因是由BMPR-1B基因突变引起，突变体BB使得受体对配体GDF5和BMP4不敏感，从而高剂量的GDF5抑制了孕酮的分泌，使排卵率上升。目前大量的研究已证明BMPR-1B基因的FecB突变位点是绵羊的多胎主效基因。青海省养羊业的基本情况是饲养绵羊数量在牲畜总数中占有的比例最多，分布最广，其组成结构主要有藏系绵羊本交选育、引用良种对当地品种改良及绒山羊改良三部分。目前青海省养羊业发展很快，并且青海又是全国养羊业的主要基地，不仅具有遗传资源非常丰富的地方绵羊品种，如藏系绵羊、小尾寒羊等，而且又有从国外引进的各种优良肉用品种，如无角陶赛特羊、萨福克羊和夏洛莱羊等。但长期以来青海养羊业生产力水平比较低，如何提高生产实际中绵羊的繁殖性能一直是困扰养羊业经济效益的关键技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种绵羊多胎性状的间接ELISA快速检测方法建立及应用，可利用绵羊的多胎主效基因(FecB基因)进行快速检测，筛选多胎性状绵羊，组建具有高繁殖率母羊群，为青海省养羊业快速选育多胎性状绵羊提供理论依据和实践基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种绵羊多胎性状的间接ELISA快速检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测绵羊的RNA，反转录后利用引物克隆FecB基因，利用克隆得到的所述FecB基因构建克隆载体；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；

(2)将所述克隆载体与真核质粒载体进行连接后，转染Sf9昆虫细胞，进行真核表达，得重组蛋白FecB；

(3)以所述重组蛋白FecB作为抗原免疫小鼠，筛选后得单克隆抗体；

(4)利用所述单克隆抗体进行间接ELISA检测，当显示抗体阳性时，则所述待测绵羊含有多胎主效基因(FecB基因)，具有产多羔潜力。

优选的，步骤(1)中提取待测绵羊卵巢的RNA。

优选的，步骤(2)所述真核质粒载体的来源包括pcDNA3.1a。

优选的，步骤(3)所述免疫的方法包括进行3次免疫，相邻两次免疫的时间间隔为14d；在进行所述免疫时，第一次免疫时向小鼠注射重组蛋白FecB和完全弗氏佐剂的等体积混合物；第二次免疫时向小鼠注射重组蛋白FecB和不完全弗氏佐剂的等体积混合物；第三次免疫时向小鼠注射重组蛋白FecB和不完全弗氏佐剂的等体积混合物；所述3次免疫时，每次免疫的注射量为100μg/只。

本发明还提供了一种绵羊多胎性状的间接ELISA快速检测方法在检测绵羊多胎性状中的应用。