[发明专利]一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法

说明书

本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法，属于基因工程技术领域，所述方法通过对核黄素生产菌株进行遗传修饰，去除胞内高水平GTP对pyr operon的激活机制，将pyr operon的表达稳定在低水平，以减少嘧啶核苷酸从头合成途径的代谢通量，增大PRPP进入嘌呤核苷酸合成途径的比例，从而提高核黄素的产量和收率，降低核黄素发酵成本。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法。

背景技术

核黄素（riboflavin）是核醇与6，7-二甲基异咯嗪的缩合物，即维生素B₂。核黄素在细胞内以黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的形式存在，作为氧化还原酶的辅酶，在代谢反应中起氢载体的作用。人和动物都缺乏核黄素合成途径，属于核黄素异养型。核黄素是人和动物的必需生长因子，在某些情况下会出现核黄素缺乏症。因此，核黄素作为饲料添加剂、食品添加剂和药品被普遍使用。目前，全世界核黄素年产销量超过万吨，其中70 %用于畜牧养殖业，30 %用于食品和医药行业。

工业上普遍采用重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵生产核黄素。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，是公认的GRAS（Generally Recognized as Safe）菌株，适用于发酵生产食品和药品。野生型枯草芽孢杆菌具有从无到有的核黄素生物合成途径（图1），但是，由于存在严谨的代谢调控机制，而不能过量合成核黄素，也不能在发酵液中积累核黄素。采用基因工程技术，对野生型枯草芽孢杆菌进行遗传改造，可以使重组枯草芽孢杆菌过量合成并积累核黄素，并应用于工业发酵生产核黄素。主要遗传改造位点及生理效应包括：（1）ribC基因点突变，导致其编码的黄素激酶/FAD合成酶的黄素激酶活性大幅度降低，最大程度地降低核黄素转化为FMN的反应速率，使核黄素能够积累；（2）对嘌呤核苷酸合成操纵子（puroperon）进行遗传修饰，去除嘌呤核苷酸对其表达的反馈抑制机制，并提高其表达水平，使细胞能够过量合成次黄嘌呤核苷酸（IMP）；（3）缺陷腺苷酸琥珀酸合成酶基因（purA），阻断IMP转化为AMP的分支代谢，为GTP的合成提供足够的IMP，为核黄素合成提供充足的前体物；（4）修饰核黄素操纵子（rib operon），解除FMN对其表达的反馈抑制作用，同时提高其表达水平，使细胞的核黄素合成途径的代谢通量尽可能提高。上述遗传改造所形成的重组枯草芽孢杆菌，能够过量合成并在胞外积累核黄素，而被用于核黄素的工业发酵生产。

目前，重组枯草芽孢杆菌工业发酵菌种存在的最主要问题是：核黄素的实际收率远低于理论收率，收率指消耗一克葡萄糖能够得到的核黄素克数。理论收率应该接近0.40g，而不同来源生产菌株的实际收率在0.025-0.06 g之间。低收率导致核黄素发酵生产成本较高，提高收率是核黄素发酵生产技术中亟待解决的瓶颈问题。